Способ получения грибной сорбирующей субстанции

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИБНОЙ СОРБИРУЮЩЕЙ СУБСТАНЦИИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гончарова Инесса Адамовна Ровбель Наталия Михайловна Бабицкая Валентина Григорьевна Щерба Виктор Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ получения грибной сорбирующей субстанции путем глубинного культивирования высшего базидиального гриба на питательной среде в течение 42-48 ч в условиях аэрации с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что высший базидиальный гриб выбирают изБИМ -306 Д,БИМ -307 Д,БИМ -305 Д,БИМ -323 Д иБИМ-325 Д, отделенную биомассу подвергают замораживанию-оттаиванию, получают фракцию клеточных стенок, обрабатывают ее 4 М мочевиной, промывают водой, отфильтровывают и высушивают сорбирующую субстанцию при температуре от -18 С до -20 С. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что базидиальный гриб культивируют на питательной среде, которую готовят на основе сухой молочной сыворотки, взятой в количестве 30 г/л, и дрожжевого экстракта, взятого в количестве 4 г/л, при рН 4,5-5,0 и температуре от 22 С до 24 С. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения грибной сорбирующей субстанции путем микробиологического синтеза, которая может найти применение в пищевой промышленности для получения биологически активных добавок и функциональных продуктов питания с сорбционными свойствами для профилактики заболеваний, связанных с накоплением в организме человека тяжелых металлов, радионуклидов и других токсикантов. Известен Способ получения хитинсодержащего сорбента из плодовых тел гриба 1. Недостатком этого способа является использование плодовых тел,выращенных на сельскохозяйственных отходах, которые, как правило, имеют определен 9394 1 2007.06.30 ный фон загрязнения. Использование такого сырья вызывает необходимость его специальной очистки, что значительно усложняет технологический процесс. Известен Способ получения хитинсодержащего материала на основе плодовых тел и мицелия базидиальных грибов путем обработки их щелочью и органическими растворителями в порядке понижения их точек кипения. Материал рекомендован для использования в качестве сорбента ионов тяжелых металлов, в том числе радиоактивных,трансурановых и редкоземельных элементов 2. Недостатком данного способа является его экологическая вредность, вызванная применением щелочей и летучих соединений(пропиловый спирт, ацетон, этиловый эфир), пары которых опасны для здоровья. Известен Способ получения глюкан-хитозанового комплекса из хитинсодержащих микроскопических грибов,и др., предназначенного для использования в качестве сорбента ионов тяжелых металлов при водоочистке в медицине, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. Комплекс получают депротеинизацией мицелия путем обработки разбавленными растворами едкого натра и минеральных кислот с последующим деацетилированием полученного продукта 20-29 водным раствором едкого натра при температуре 110-125 С 3. Недостатком данного способа является использование агрессивных веществ и высоких температур, что удорожает процесс и наносит ущерб окружающей среде. Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому результату является Способ получения пищевого биосорбента 4 путем глубинного культивирования гриба(штаммы ВКМП -697 и -720) в условиях аэрации при рН 6,0-7,5, температуре 26-28 С с последующей сушкой биомассы при температуре 50-60 С. Выход биомассы на стадии ферментации составляет 10-15 г/л. Недостатками данного способа являются невысокое содержание в биомассе гриба хитиноглюканов (ХТГ), определяющих сорбционный потенциал сорбента, 50,4-60,3 применение в качестве биосорбента цельной биомассы, содержащей, кроме неперевариваемой сорбирующей субстанции - хитин-глюканового комплекса (ХГК), входящего в состав ХТГ, другие компоненты, снижающие сорбционный потенциал низкая сорбция пищевым биосорбентом свинца Р 2 - 50,5 мг/г (наиболее опасного поллютанта из-за способности накапливаться в организме) и меди С 2 - 25,3 мг/г (распространенного высокотоксичного поллютанта поверхностных и подземных вод) предпочтительность связывания пищевым биосорбентом дефицитного в растительных продуктах микроэлемента цинка (2) - 120 мг/г выращивание гриба при высоком рН среды (6,0-7,5), что вызывает необходимость поддержания строго стерильных условий. Задачей данного изобретения является разработка более экономичного экологически чистого способа получения грибной сорбирующей субстанции, освобожденной от балластных веществ цитозоля, способной более эффективно извлекать тяжелые металлы и радионуклиды, в первую очередь свинец (не снижая при этом содержания микроэлемента цинка), а также эндотоксины. Поставленная задача решается путем глубинного культивирования базидиальных грибов на питательных средах в условиях аэрации с последующим отделением биомассы, полученную биомассу подвергают замораживанию-оттаиванию с последующей обработкой 4 М раствором мочевины и удалением избыточной влаги методом вымораживания при отрицательных температурах для получения депротеинизированных клеточных стенок. Продуценты - штаммы высших базидиальных грибов .БИМ -306 Д, .БИМ -307 Д, .БИМ -305 Д, .БИМ -323 Д, .БИМ-325 Д, культивирование ведут в ферментерах при исходном рН среды 4,5-5,0, температуре 22-24 С в течение 42-48 часов. 9394 1 2007.06.30 Культивирование грибов ведут на питательной среде, которую готовят на основе сухой молочной сыворотки, взятой в количестве 30 г/л, и дрожжевого экстракта, взятого в количестве 4 г/л. Выделение из биомассы клеточных стенок путем последовательного замораживанияоттаивания в сочетании с гомогенизацией и отмывкой водой приводит к удалению цитоплазматической мембраны и внутриклеточного содержимого. Полученная таким образом фракция клеточных стенок подвергается обработке 4 М раствором мочевины - реагентом,обладающим выраженным солюбилизирующим действием, далее следует промывка водой и высушивание грибной сорбирующей субстанции при температуре от -18 С до -20 С. Представленные среды являются оптимальными для получения биомассы с высоким содержанием клеточных стенок и грибной сорбирующей субстанции с выраженной сорбционной способностью при сравнении с глюкозо-пептонной средой или крахмалосодержащими средами. Применяемые в способе штаммы-продуценты .БИМ -306 Д, .БИМ -307 Д, .БИМ -305 Д, .БИМ -323 Д, .БИМ -325 Д выделены из плодовых тел. При высеве глубинного мицелия на плотные питательные среды быстро образуются плодовые тела. Культуры депонированы в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси, хранятся в лаборатории экспериментальной микологии этого же Института. Сведения, подтверждающие возможность осуществления предлагаемого изобретения. Пример 1. Грибы культивируют на агаризованной глюкозо-пептонной среде при 22-24 С в течение 7 сут, затем переносят стерильной лопаткой в качалочные колбы вместимостью 2 л с 800 мл жидкой глюкозо-пептонной среды. Колбы помещают на качалку (160-180 об/мин) при 22-24 С на 36-42 ч. Выращенный посевной материал стерильно переносят в ферментер объемом 300 л с той же средой. Культивирование ведется при аэрации 0,5 л/л среды в мин и скорости вращения мешалки 100 об/мин, продолжительность - 42-48 ч. Выход сухой биомассы 14,2 - 15,6 г/л. Биомасса отфильтровывается, отмывается от компонентов питательной среды, подвергается последовательному замораживанию-оттаиванию в сочетании с гомогенизацией и отмывкой водой (3-4 раза). Удаление внутриклеточного содержимого контролируется с помощью микроскопирования (увеличение 900 раз). Полученная таким образом фракция клеточных стенок обрабатывается 4 М мочевиной в течение 10 часов при периодическом перемешивании, полученная грибная сорбирующая субстанция промывается водой, отфильтровывается и сушится в открытой емкости в морозильной камере при температуре 18 - 20 С. Полученная грибная сорбирующая субстанция представляет собой депротеинизированные клеточные стенки, на 96-98 состоящие из ХГК. Ниже представлены данные по выходу биомассы и содержанию основных компонентов биомассы (табл. 1). В табл. 2 приведены данные по сорбционной активности грибной сорбирующей субстанции. Таблица 1 Компоненты биомассы,Выход биомассы,Гриб г/л ХТГ белок клеточные стенки 9394 1 2007.06.30 Таблица 2 Полная обменная емкость, мг/г Сорбционная емкость по метилеГриб 2 2 2 2 3 новому голубому,.БИМ -307 Д 153,6 214,8 24,0 65,3 60,4 190,2 3 Коэффициент распределения (КД, см /г) грибной сорбирующей субстанции .БИМ -307 Д в отношении извлечения радионуклидов 85 - 720 137 - 250. Пример 2. Грибы культивируют аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется сухая молочная сыворотка - 30 г/л и дрожжевой экстракт - 4 г/л. В предложенной среде сухая молочная сыворотка, являющаяся отходом молочной промышленности, выступает как источник углерода (лактоза вместо глюкозы, как в примере 1),а также минеральных солей, витаминов и др. дрожжевой экстракт - не только источник органического азота (вместо пептона, как в примере 1), но и ростовых факторов. Данная среда приводит к повышению выхода биомассы более чем на 25 клеточных стенок и ХТГ - более чем 20 . Ниже представлены данные по выходу биомассы и содержанию основных компонентов биомассы (табл. 3). В табл. 4 приведены данные по сорбционной активности грибной сорбирующей субстанции. Таблица 3 Выход биомассы,Компоненты биомассы,Гриб г/л ХТГ белок клеточные стенки.БИМ -307 Д 18,8 72,0 16,0 57,4 Таблица 4 Полная обменная емкость, мг/г Сорбционная емкость по метилеГриб 2 2 2 2 3 новому голубому,.БИМ -307 Д в отношении извлечения радионуклидов 85 - 755 137 - 280. 9394 1 2007.06.30 Предлагаемый способ получения грибной сорбирующей субстанции по показателям сорбционной активности по отношению к ионам свинца значительно превосходит прототип (табл. 5). Таблица 5 Депротеинизированные Ион металла Прототип клеточные стенки гриба .БИМ -307 Д 2 80,1 161,6 3 55,0 63,7 С Преимущество предлагаемой грибной сорбирующей субстанции 1. Грибная сорбирующая субстанция, представляющая собой депротеинизированные клеточные стенки базидиальных грибов, сорбирует преимущественно высокотоксичные ионы свинца и кадмия, не затрагивая ценный для здоровья микроэлемент цинк. 2. Получение грибной сорбирующей субстанции не связано с применением экологически вредных веществ. 3. При получении субстанции грибы выращиваются в кислой среде (рН 4,5-5,0 против 6,0-7,5), что не требует жестких условий стерильности. 4. При культивировании грибов используются дешевые питательные субстраты (сухая молочная сыворотка и дрожжевой экстракт), обеспечивающие более высокое содержание ХТГ, чем крахмалосодержащие среды (66,5-72,0 против 50,4-60,3). Источники информации 1. Урьяш В.Ф., Масова В.А., Туманова А.Н., Демарин В.Т., Кралина Н.Н., Гриб П.Т. Изучение процесса сорбции тяжелых металлов хитином из грибов Вешенка. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. - М. ВНИРО. - 1999. - С. 280. 2. Патент РФ 2073015, МПК 6 С 08 В 37/08. 3. Патент РФ 2043995, МПК 6 С 08 В 37/08, С 12 Р 19/04. 4. Патент РФ 2219997, МПК 7 В 01 20/22. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5