Способ получения микрокапсулы полипептида

Изобретение относится к микрокапсулам,предназначенным для длительного высвобождения физиологически активного пептида.Известен способ получения микрокапсулы полштептида, предназначенный для высвобождения физиологически активного полипептида по нулевому порядку в течение, по меньшей мере, двух месяцев путем диспергирования эмульсии типа вода-в масле в водной среде с последующим высушиванием 1.В соответствии с этим способом лекарство можно заключать в микрокапсулы с меньшим первоначальным высвобождением.В случае назначения лекарства в форме мшсрокапсул требования к микрокапсулам, имеющим большую зависимость от взаимосвязи с функциями живого организма, можно разделить на ряд фаз. Поскольку это связано с медициной, нужны микрокапсулы, которые смогли бы по возможности удовлетворить эти различные требования.Существуют микрокапсулы, включающие водорастворимое лекарство с использованием биоразлагающегося полимера. Однако, в случае использования водорастворимого лекарства, особенно физиологически активного пептида с относительно большим молекулярным весом, диффузия лекарства, заключенного таким образом в полимер, низкая, и поэтому лекарство не высвобождается на первоначальной стадии до тех пор, пока не начнется разложение или пропитка полимера, и наоборот, в зависимости от способа приготовления трудно избежать большого выброса на первоначальной стадии, таким образом при использовании в качестве лекарства часто возникают практические трудности. В частности,при дшттельном высвобождении фармацевтических композиций в течение большого периода времени постоянный выход лекарства с большой точностью является важным требованием, но микрокапсулы, удовлетворяющие эти требования, не бьши известны.В соответствии с настоящим изобретением получают микрокапсулы, предназначенные для высвобождения в нулевом порядке физиологически активного полипептида на протяжении, по меньшей мере, двух месяцев.Согласно изобретению эмульсию вода-в масле получают смешением водной фазы, содержащей 20-70 мас. полипептида, возможно,поливиниловый спирт, с масляной фазой, содержащей сополимер или гомополимер молочной и гликолевой кислот со средней молекул-гирькой массой 7000-30000, причем соотношение молочной и гликолевой кислот составляет 8020 - 1000полипептид представляет собой полипептид,содержащий два или более аминокислотных остатка с молекулярным весом 200-100000, 10или лютейнизирующий гормон или аналогичный, растворимый в воде с молекулярным весом 1000 И более, или иолипептид формулысополимер представляет собой сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением 9010 - 1000гомополимер представляет собой полимолочную кислоту с молекулярньш весом от 7000 до 25000водная фаза содержит от 25 до 65 И, мас. полипептидаводная фаза содержит от 35 до 60 мас. полипептида.Микрокапсулы с пролонгированным высвобождением по настоящему изобретению штовятся следующим образом.Вначале физиологически активный пептид добавляется к воде в количестве для упомянутой концентрации, в которой далее при необходимости добавляется вещество, сохраняющее лекарство, такое как вышеупомянутый желатин или основная аминокислота, чтобы раствор или суспензия имели нужную концентрацию Для получения внутренней водной фазы.К этой внутренней водной фазе можно добавить рН регулирующий агент для поддержания стабильности или растворимости физиологически активного пептида, такой как угольная кислота, уксусная, щавелевая, лимонная, фосфорная, соляная кислота, гидроокись натрия, аримин, лизин и их соли. Еще можно добавить в качестве стабилизатора физиологически активного пептида белок, желатин, лимонную кислоту, натрий,этилендиамин тетраацетат, декстрин, кислый сульфит натрия или полиоловое соединение,такое как полиэтилен гликоль. В качестве консерватора можно ввести обычные вещества, такие как параоксибензойной кислоты эфир,например метилпарабеи, пропилпарабен, бензиловый спирт, хлорбутавол или тимерозал.Полученная таким образом внутренняя водная фаза добавляется к подшмерсодержащему раствору (масляная фаза) с последующей процедурой эмульгирования для получения эмульсии типа в/м. Для процедуры эмульгирования используется известный способ получения дисперсии. Как, например, способ перемежающегося встряхивания, использующий миксер типа пропел- лерной мешалки. турбинной мешалки или т.п., коллоидную мельницу. способ гомогенизации или ультразвуковой способ.Далее приготовленная таким образом эмульсия подвергается микрокапсулированию. Как средство для микрокапсуляции может использоваться способ высушивания в воде или фа озоной сепарации. В случае приготовления микРОКНПСУП НЫСУШИВЕНПВМ В ВОДЕ указанная В/М эмульсия далее добавляется к третьей водной фазе для получения тройной в/ м/ в эмульсии,ПОСЛЕ ЭТОГО растворитель В МЗСЛЯНОЙ фазе ВЫпаривается до получения микрокапсул.К внешней водной фазе может быть добавлен эмульгирующий агент. В качестве такового можно использовать любой агент, способный образовать стабильную м/в/м эмульсию, например анионное поверхностно-активное вещество, например олеат натрия, стеарат натрия, натрий лаурил сульфат И Т.П., НЕПОНное поверхностно-активное вещество, например пояшоксиэтиленсорбентный эфир жирной кислоты (Туз/сип 80, Титепп 60 продукты Ат 1 а Рочтаег Со), полиоксизтилен производное касторовое масло (НСО-60, НСО 50, продукты ЪНККО С 11 еш 1 са 1 а) и т.п., поливинил пирролиДОН, ПОДПППГНРЪПОВЫЙ СПИРТ, КЗРООКСИМСТИДЦБЛлюлозу, лецитин или желатин. Такие эмульгаторы можно использовать по отдельности или в комбинации. Концентраты эмульгирующего агента выбирается в пределах 0,01-2 О, предпочтительно 0,05-10.Для вьшаривания растворителя из масляной фазы используется любой из традиционных способов. Способ осуществляется постепенным снижением давления с одновременным переМСЩИВЗНИСМ ПрОПСЛЛСрНОЙ ИЛИ МЗГНИТНОЙ МВшалкой шш использованием вращающегося испарителя С регулированием СТЕПЕНИ ВНКУУ ма. В этом случае необходимое время можно уменьшить постепенным согреванием в/м/ в ЭМУЛЬСИИ ПОСЛЕ ЗНТВЕРДЕВЗНИЯ полимера ДО некоторой степени, чтобы полнее удалить растворитель.Полученные таким образом микрокапсулы собираются центрифугированием или фильтрацией, промываются несколько раз дистиллированной водой для удаления свободного физиологически активного пептида, вещества,сохраНЯЮЩВГО лекарство, И эмульгирующего ЗГБНТЗ, ПРИЛИПШСТО К ПОВЕРХНОСТИ МИКРОКЗПсупы, с последующей дисперсией полученного ВЕЩВСТБЗ В ДИСТШШИРОВНННОИ ВОДЕ И ВЫСУШЕванием при температуре ниже 0 С, при необходимости согреванием при пониженном ДЗВЛСНИИ ДЛЯ БОЛЕЕ ПОЛНОГО УДЗЛСНИЯ ВЛНГИ В микрокапсулак и растворителя в стенке микрокапсулы.В случае приготовления микрокапсул способом фазовой сепарации агент коацервации медленно добавляется к упомянутой в/м ЭМУЛЬСИИ ПРИ ПВРСМСШИВЗНИИ, ЧТОБЫ ДЕТЬ ПО лимеру ОСЕСТЪ И ЗЕТНСРДВТЬ. АГСНТОМ КОНЦЕРвации может быть любое способное СМШИВНТЬСЯ С растворителем ПОЛИМСРНОВ СОЕДИНЕНИЕ. СОЕДИНЕНИЯ МИНСРЭЛЬНОГО ИЛИ рНСТИТСЛЬНОГО МЗСЛЗ, например СИЛИКОНОВОмасло, кунжутнощсоевое, кукурузное, хлопковое, кокосовое, льняное масло, минеральные масла, н-гетан, н-гептан, т.п. Их можно использовать в смеси из двух или нескольких.Полученные микрокапсулы собираются фильтрацией и промываются, например гептаном повторно, чтобы удалить бедный растворитель полимера. Далее удаление свободного лекарства и отделение растворителя проводится так же, как в способе высушивания в воде. Для противодействия слипанию микрокапсул одна с дРУгой во время промывания может быть добавлен агент.Микрокапсулы настоящего изобретения,предназначенные для продолжительного высвобождения, полученные способом высушивания в воде, обладают лучшими и более стабильными свойствами длительного высвобождения на протяжении большего периода времени.Микрокапсулы по предлагаемому способу назначаются в виде инъекций, импланташш и в виде агентов, поглощаемых слизистой оболочкой прямой кишки или матки. После легкого дробления при необходимости микрокапсулы просеиваются для удаления слишком больших из них. Средний размер гранул микрокапсул 0,51000 им, предпочтительно 2-500 им. Если микрокапсулы используются в виде инъекций в форме суспензии, размер гранул должен быть достаточным и удовлетворять требованиям дисперсности и введения в виде инъекций,например в пределах 2-100 им.Микрокапсулы, полученные способами по этому изобретению, имеют много преимуществ. Например, они почти не подвержены слипанню при изготовлении. Можно изготовить микрокапсулы, которые могут быть сферическими по форме с разными размерами. Ступень удаления растворителя из масляной фазы легко проконтролировать, следовательно,также можно контролировать поверхностную структуру микрокапсул, что является решающим фактором в скорости высвобождения лекарства.Микрокапсулы, полученные данным способом, можно свободно назначать в виде инъекций и имплантировать внутримышечно,подкожно, внутривенно или на орган, суставную полость или на поражение, такое как опухоли. Их также можно назначать в различной дозировке и использовать как материал при приготовлении таких форм дозировок. Например, в пршотовлении микрокапсул по этому изобретению для инъекций они диспергируются в водной среде вместе с диспергирующнм агентом, например Тшееп 80 НСО-60, карбоксиметилцеллюлоза, алгинат натрия и т.п., консервантом, например метилпарабен, пропилпарабен и т.п., изотонирую 7 ВУ 1360 С 1 вщим агентом, например хлорид натрия, маннит, сорбит, глюкоза и т.п., или суспендируются в водной среде вместе с растительным маслом, таким как кунжутное масло или кукурузное масло. Такая дисперсия или суспензия формируется в практически используемый инъекционный раствор пролонгированного действия.Микрокапсулированный инъекционный раствор с пролонгированным действием можно преобразовать в более стабильный инъекционный раствор добавлением дополнительного наполнителя, например маннит, сорбит, лактоза,глюкоза, и т.д., повторным диспергированием полученной смеси и отвердением посредством высушивания при температуре ниже 0 С или распылительным высушиванием с добавлением дистиллированной воды инъекций или какоголибо соответствующего диспергирующего агента.Доза препарата с длительным высвобождением в соответствии с данным изобретением может меняться в зависимости от вида и количества физиологически активного пептида,который является активным ингредиентом,формы дозировки, длительности или высвобождения лекарства, животного-реципиента,например теплокровных животных, таких как мышь, крыса, кролик, овца, свинья, корова,лошадь, человек, и цели назначения, но должна быть в пределах диапазона эффективной дозы данного активного ингредиента, например, разовую дозу михрокапсул на данное животное можно адекватно выбрать в пределах от 0,1 мг до 100 мг/ кг веса тела, предпочтительно 0,2 мг-БО мг/ кг веса тела.Таким образом, получена фармацевтическая композгщия, приготовленная в форме микрокапсул, которые включают эффективность, но большее количество физиологически активного пептида по сравнению с обычной единой дозой и бносовмесгимый полимер, и способная высвобождать лекарство непрерывно на протяжении длительного периода времени.Препарат длительного высвобождения в соответствии с настоящим изобретением обладает среди других следующими характеристиками1. Непрерывное длительное высвобождение физиологически активного пептида достигает ся в различшяк формах дозировки. В частноститам, где требуется долгосрочное лечение, желаемых терапевтических эффектов можно достичь при стабильном действии инъекцией препарата раз в три месяца или раз в шесть месяцев вместо ежедневного назначения. Таким образом. указанный препарат достигает ДЛИТСДТЬНОТО БЫСВО 6 ОЖДСНИЯ ЛКЗРСТВЗ на ПрОтяжении большего периода по сравнению с обычными препаратами такого действия2. Если препарат, в котором используется биоразлагаемый полимер, назначается в форме инъекций, такой хирургической операции, как имплантация, больше не требуется, препарат можно назначать подкожно, внутримышечно или на орган или пораженный участок с легкостью таким же образом, как обычные суспензионные инъекции. Нет необходимости удалять матрицу из тела после завершения высвобождения лекарства.Следующий стандартный пример и примеры иллюстрируют изобретение более подробно.Стандартный пример. Четырехгорлая колба,снабженная термометром, холодильником и вводом для азота, загружалась 160 г 85 -го водного раствора ПЬ-молочной кислоты. Раствор нагревался при пониженном давлении 6 ч в потоках азота при внутренней температуре и давлении в пределах от 105 С и 350 мм рт.ст. до 150 С и 30 мм рт.ст. для удаления дистиллированной таким образом воды. Реакция продолжалась при 175 С 90 ч при пониженном давлении 3-5 мм рт.ст., далее охлаждалась до комнатной температуры для получения 98 г практически бесцветного плотного полимера. Этот полимер растворялся в тетрагидрофуране, среднемассовая молекулярная масса и степень дисперсии определялась посредством гелеопроницаемой хроматографии с использованием коммерчески доступного полистирола со стандартной молекулярной массой 17,200 и 1,89 соответственно.Пример 1. ТАР-144 (400 мг) растворялся в 0,5 мл дистиллированной воды для получения водной фазы. Водный раствор добавлялся к раствору 4 г поли-ПЬ-молочной кислоты Ьот На 870818, среднемассовая молекулярная масса 18,000 микрокапсула Ьот Ы 9 244, 245 и 1.01 Не 880622, среднемассовая молекулярная масса 18,200, дисперсность 1,76 микрокапсула 1.0 Не 248 в 7,5 мл дихлорметана. Смесь перемешивалась в гомогенизаторе небольшого размера (РоЩгоп продукт Кгпешатйса Швейцария) около 60 с для получения в/ м эмульсии. Эта эмульсия охлаждалась до 15 С. Затем она выливалась в 1,000 мл 0,25 -го водного раствора, ранее охлажденного при 15 С,поливиниловою спирта (ПЕС) и перемешивалась небольшим гомогенизатором для получения в/ м/ в эмульсии. После этого дихлорметан выпаривался при перемешивании в/м/в эмульсии, чтобы таким образом отвердить внутреннюю в/м эмульсию с последующим сбором такого отвердевшего материала центрифугированиеьс.Материал вновь диспергировался в дистиллированной воде с последующим центрифугированием, промыванием лекарства и диспергирующвй агент затем выделялся в свободном состоянии.Собранные таким образом микрокапсулы подвергались высушиванию при температуре ниже 0 С для удаления растворителя, более полною обезвоживания и получения порошкообразного продукта. Содержание лекарства,захваченного в капсулах (Ьог 244, 245, 248),указывалось как 9, и коэффициент захвата составлял 100 или больше.Эти мирокапсулы назначались крысам (п 5) для подкожного применения, затем ТАР 144, оставшийся в микрокапсулах, определялся количественно в месте введения инъекции для измерения ин виво скорости высвобождения лекарства. Результаты даны в табл.1. Эти капсулы не показывают первоначального выброса, а продолжительное высвобождение ТАР-144 наблюдалось в течение 14 недель, т.е. больше 3 месяцев с хорошей воспроизводимоСТЬЮ.Пример 2. Таким образом ТАР-144 (400 мг) растворялся в 0,5 мл дистиллированной воды для получения водной фазы 4 г ноли-ПЬ-молочной кислоты со среднемассовой молекулярной массой 8 400 (Ьот 870304, микрокапсула Ьот 312) и затем растворялся в 5 мл дихлорметана для получения масляной фазы. Водная фаза и масляная фаза смешивались, как описано выше, для получения в/м эмульсии.Эта эмульсия охлаждалась до 13 С, выливалась в 1,000 мл 0,25-ю водного раствора поливинилового спирта (ПВС). Смесь обрабатывалась таким же образом, как описано выше, для получения в/м/ в эмульсии, которая готовилась в микрокапсулы.Далее 550 мг ТАР-144 растворяли в 1 мл дистиллированной воды. С другой стороны 4 мг каждого из трех образцов поли-ВЪ-молочпой кислоты (Ьот Не 890717, молекулярная масса 14,100, дисперсность 2,00, микрокапсула 12 Не 402 ш Не 890720, молекулярная масса 17,200, дисперсность 1,89, микрокапсула Ьот Не 405 1.01 М 890721, молекулярная масса 17,500, дисперсность 1,87, микрокапсула 1.01 Не 406) растворяли в 7,5 мл каждый в дихлорметане. Указанный водный раствор добавляли к каждому из трех образцов,растворенных в дихлорметане с последующей обработкой таким же образом, как и ранее для получения трех образцов в/м/ эмульсии. Полученные эмульсии выливались в 1,000 мл каждого из трех образцов 025 го водного раствора ПВС, предварительно охлажденного при 15 С (первый) и при 18 С (второй и третий), которые обрабатывались соответственно таким же образом для получения микрокапсул. Коэффициенты захвата лекарства были 101,113 и 103 соответственно.В табл) показаны скорости выхода лекарства в соответствующих микрокапсулах, измеряемых так же, как указано выше.высвобождение лекарства после небольшого количества первоначальной дозы демонстрирует непрерывное продолжительное высвобождение на протяжении свыше двух месяцев. Срок высвобождения зависел от скорости гидролиза используемого высокомолекулярното полимера.Пример 3. Микрокапсулы готовились так же,как в примере 1, из водной фазы, полученной растворением 400 мгТАР-144 в 0,5 мл дистиллированной воды, масляная фаза готовилась растворением 4 г полимолочнойгликолевой кислот (90/ 10) Ьот Мс 870320(среднемассоаая молекулярная масса 19,ООО)б микрокапсула Ьот Мг 315, от Не 891020 (среднемассовая молекулярная масса 13,800) микрокапсула Ьот Не 410. Относительно микрокапсулы 1.01 Не 410 водный раствор вотовился растворением 550 мг ТАР-144 в 1 мл дистиллированной воды и использовался как внутренняя водная фаза температура в/м эмульсии и внешней фазы доводилась до 15 и 18 С соответственно. Коэффициенты захвата лекарства в этих микрокапсулах были 106 и 100 соответственно. Эти микрокапсулы вводились крысам подкожно так же, как описывалось выше и ин виво оценивали скорости высвобождения лекарства. В табл.3 показано действие микрокапсул с продолжительным высвобождением на протяжении непрерывного периода свыше двух месяцев.Пример 4. Микрокапсулы готовились так же,как в примере 1, из водной фазы, полученной растворением 280 мг ТРГ (тиреорилизинт гормон - гормон, высвобождающий тиреотропин,в свободной форме) в 0,25 мл дистиллированной воды, и масляной фазы, полученной растворением в 6 мл дихлорметана поди-ВТ.-молочной кислоты (средняя молекулярная масса 17,200, дисперсность 1,89), используемой в примере 2, и доведением температуры в/м эмульсии и внешней водной фазы до 15 С.Коэффициент захвата лекарства в полученных микрокапсула) (До По Р-103) составлял 85,8.Табл.4 показывает, что высвобождение лекарства в таких микрокапсулак составляло большой период - около трех месяцев.