Способ определения активности фосфолипазы A2 в сыворотке крови

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ 2 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Скоростецкая Лидия Адамовна Кучуро Светлана Викторовна Рахуба Галина Николаевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) ГОЛОВАЧ О.Н. и др. Международная научная конференция. Молекулярные,мембранные и клеточные основы функционирования биосистем Сб. статей. Ч. . - Минск, 2004. - С. 225-227. АХРЕМ А.М. и др. Биохимия, 1989. Т. 54. Вып. 4. - С. 687-693. ЛИТВИНКО Н.М. Структурно-функциональные закономерности гидролиза фосфолипидов под действием фосфолипаз 2 и(активностьи, уровни регуляции). Автореферат диссертации. - Минск, 2000. С. 12-13.1416918 1, 1988.(57) Способ определения активности фосфолипазы А 2 в сыворотке крови, отличающийся тем, что к мицеллам, полученным в буферном растворе со значением рН от 7,4 до 10,0 из фосфатидилхолина яичного желтка и Тритона Х-100, взятых в соотношении от 12 до 13,добавляют 2 до концентрации 1-2 мМ и раствор метгемоглобина до концентрации 3-12 мкМ, после чего в один образец добавляют сыворотку крови, а во второй - буферный раствор, регистрируют дифференциальный спектр поглощения метгемоглобина в образцах, определяют на спектре разницу между поглощением при длинах волн 423 и 405 нм и по калибровочному графику определяют активность фосфолипазы А 2. Изобретение относится к области клинической биохимии и биотехнологии, в частности к способу определения в сыворотке крови активности одного их важнейших ферментов липидного метаболизма - фосфолипазы А 2, уровень которой является патогенетическим признаком острого некротического панкреатита и других воспалительных заболеваний 1. Фосфолипаза А 2 (ФЛА 2, 1) - липолитический фермент, катализирующий гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицеринового скелета молекулы фосфолипидов, в результате чего образуются биоактивные лизофосфолипиды и жирные кислоты. Фосфолипазы и продукты осуществляемых ими ферментативных процессов участвуют в многоэтапном каскаде биохимических реакций, имеющих важное значение в обеспечении жизнедеятельности организма, и, в частности, значительное увеличение активности ФЛА 2 12552 1 2009.10.30 в органах и тканях происходит при многих заболеваниях, угрожающих жизни человека, остром панкреатите, развитии воспалительных и онкологических процессов, тромбообразовании, ишемии тканей, язвенной болезни, отеках вследствие радиационного поражения и других. За последние 20 лет отмечается увеличение частоты заболеваний поджелудочной железы, в частности, резко увеличилась частота острого панкреатита - в 40 раз. В настоящее время среди заболеваний органов брюшной полости, требующих неотложных хирургических мер, острый панкреатит по частоте встречаемости стоит на третьем месте после острого аппендицита и холецистита. Общая летальность при остром панкреатите достигает 21 , а при деструктивных формах - 80 . Среди выживших больных у 50-73 возникает утрата трудоспособности или инвалидизация на длительный период. Поскольку наиболее часто заболевают люди активного трудоспособного возраста (20-60 лет), диагностику и лечение острого панкреатита следует отнести к приоритетным медико-социальным проблемам. Во многом летальность при этой патологии обусловлена диагностическими трудностями, отсутствием надежных, специфических методов своевременного выявления этой болезни. Из изложенного ясна острая необходимость дальнейшей разработки и оптимизации диагностики указанных выше заболеваний, среди которых определение активности ФЛА 2 имеет решающее значение и многообещающие перспективы использования в клинической лабораторной практике. Существующие методы клинико-лабораторной диагностики практически исчерпали свой потенциал. Известны методы определения фосфолипазной активности в научно-исследовательской практике титриметрический (ацидометрический) и радиометрический 2, 3, с использованием кондуктометрии, газожидкостной хроматографии меченых соединений,полярографии с одновременным определением активности липоксигеназы, электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 4, флуоресцентно- и спин-меченых фосфолипидных субстратов, а также их тиоэфирных аналогов 47. Однако имеющиеся методики определения активности ФЛА 2 трудоемки, требуют больших затрат фермента, субстратов и времени, а также специального дорогостоящего оборудования, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения активности этого жизненно важного фермента 2-8. Для использования в клинико-лабораторной практике до сих пор не разработаны удобные методы определения активности ФЛА 2. Это обусловлено тем, что пока не найдены пути устранения методических трудностей, связанных с созданием оптимальных условий формирования субстрата (фосфолипида) ферментативной реакции и условий ее проведения в связи с тем, что фермент хорошо растворим в воде, а его субстрат - гидрофобное органическое соединение. Одним из классических методов определения активности фосфолипазы А 2 в клинических биохимических лабораториях является способ, состоящий в определении количества высвободившихся жирных кислот после инкубации сыворотки с субстратом, содержащим лецитин. Недостатком этого метода является необходимость использовать большое количество биологического материала, длительность инкубации в течение 18 ч, притом при температуре 55 С. Для выполнения метода необходимо применение в качестве субстрата лецитина (фосфатидилхолина), детергента дезоксихолата натрия, глицина и реактивов,используемых для определения содержания жирных кислот 9. Выполнение наиболее точного - хроматографического - метода, включающего в себя этапы экстракции продуктов реакции, их разделения с помощью тонкослойной хроматографии и последующего количественного определения образующихся лизофосфатидилхолинов и оставшихся непрореагировавшими фосфатидилхолинов по содержанию в них фосфора, занимает до пяти суток 10. Недостатками этих методов также являются отсутствие возможности непрерывного контроля над ходом гидролиза и низкая специфичность исследования в случае примене 2 12552 1 2009.10.30 ния материала, содержащего смесь разных липолитических ферментов, в том числе и биологических жидкостей. Синтетические субстраты, применяемые в данных способах анализа, по молекулярной структуре значительно отличаются от природных. Это может сказываться на величине специфической ферментативной активности. Известен способ определения активности ФЛА 2, основанный на реакции превращения метгемоглобина в гемихром под действием жирной кислоты 11-13. Метод основан на спектрофотометрической регистрации модифицированных форм гемоглобина после внесения метгемоглобина совместно с фосфатидилхолином (концентрация 1,2 мМ) в суспензию альвеолярных макрофагов или в среду их культивирования. Недостаток метода позволяет определить активность ФЛА 2 в указанном биологическом материале только в предварительно обогащенном и активированном исходном материале (прототип) 13, что ограничивает его возможности. Задачей настоящего изобретения является способ определения активности фосфолипазы А 2 в сыворотке крови с целью повышения его чувствительности при снижении требуемого для анализа количества сыворотки. Поставленная задача решается способом определения активности фосфолипазы А 2 в сыворотке крови с помощью дифференциальной регистрирующей спектрометрии с использованием гемоглобина в качестве индикатора, который позволяет повысить чувствительность определения фосфолипазы А 2 с высокой воспроизводимостью результатов. Заявляемый способ включает в себя получение экзогенного субстрата в виде мицелл фосфатидилхолина яичного желтка и неионного детергента Тритон-100 при соотношении 12-3 с последующим приготовлением реакционной смеси, содержащей указанные мицеллы с концентрацией фосфатидилхолина 0,12-0,2 мМ, буферный раствор с рН 7,4 10,0, 1-2 мМ раствор 2 в качестве кофактора и 3-12 мкМ раствор метгемоглобина в качестве индикатора, преинкубацию полученной реакционной смеси в течение 2-5 мин при 20-37 С, добавление сыворотки крови в опытную кювету, определение с помощью дифференциальной регистрирующей спектрофотометрии интенсивности спектральных измененийс последующим расчетом активности фермента известными приемами. В процессе фосфолиполиза с участием фосфолипазы А 2 (ФЛА 2) в образцах сыворотки крови под действием продукта фосфолиполитической реакции - жирной кислоты - происходит превращение метгемоглобина в гемихром, что регистрируется при записи дифференциального спектра в видимой области по появлению пика с максимумом абсорбции при 423 нм и минимумом при 405 нм. Интенсивность поглощения между этими экстремумами пропорциональна концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2. Особенностью фосфолипазной реакции в сыворотке крови, по свидетельствам многих исследователей 14, 15, является нелинейный характер ее течения. Обычно наблюдается быстрая фаза (от 30 с до 1-2 мин), за которой в интервале от десятка минут до двух часов идет медленная фаза, характеризующаяся пологим подъемом кривой на графике зависимости скорости реакции от времени. Это создает определенные трудности для стандартизации метода. Преимуществом предлагаемого гемопротеидного метода является возможность вести наблюдение за ходом реакции в кинетическом режиме и таким способом определять оптимальное время регистрации спектров. Для препаратов сыворотки в соответствии с изобретением в условиях реакции (ФХ 0,12 мМ, НЬ 5 мкМ,Са 22 мМ,20 С) оптимальным является интервал от 5 до 10 мин, когда при достаточно большой интенсивности наблюдается линейный участок прироста . Таким образом, при использовании заявленного способа удалось повысить чувствительность определения активности фосфолипазы А 2 в сыворотке крови за счет снижения концентрации фосфатидилхолина с 1,2 мМ до 0,12 мМ в реакционной смеси при снижении требуемого для анализа количества сыворотки крови до 5-10 мкл. 12552 1 2009.10.30 Кроме того, заявляемый способ позволяет проводить определения активности фосфолипазы А 2 в сыворотке крови в статическом и динамическом режимах, что является полезным при выборе способов коррекции активности фермента. Приведенные ниже примеры определения активности ФЛА 2 в образцах сыворотки крови здоровых доноров подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1. Определение фосфолипазной реакции в образцах сыворотки крови с использованием метгемоглобина. Для проведения реакции готовят следующие реактивы 1. 0,05 М Трис-НС-буфер, рН 8,0. 2. Раствор фосфатидилхолина яичного желтка (ФХ) в хлороформе, исходная концентрация 30-50 мкмоль/мл. Хранится при -18 С. 3. Раствор метгемоглобина в Трис-НС-буфере, исходная концентрация - 30-50 мкМ(по гему). Взвешивают лиофилизованный метгемоглобин, исходя из расчета, что 1 мг сухого порошка дает около 28 нмоль по гему. Добавляют буферный раствор до концентрации 0,5 мл/мг. Оставляют на 2-3 ч для набухания, после чего раствор хорошо перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для отделения нерастворившегося белка и апогемоглобина. Регистрируют спектр поглощения разведенного в 20-40 раз супернатанта на Спекорде - либо определяют А 406 на спектрофотометре. Рассчитывают содержание метгемоглобина (по гему) с учетом разведения и длины оптического пути, используя коэффициент молярной экстинкции метгемоглобина 162000 М-1 см-1. 4. 0,1 М СаС 2. 5. 48 мМ Тритон Х-100, водный раствор. Далее готовят реакционную смесь. Для этого выпаривают исходный раствор фосфатидилхолина (ФХ) в количестве, эквивалентном 0,516 мкмоль. Оставляют на воздухе на 2030 мин для удаления паров хлороформа. Суспендируют в 100 мкл буферного раствора 0,05 М Трис-,8,0. Солюбилизируют суспензию добавлением 21,5 мкл 48 мМ раствора Тритона -100 (до соотношения ФХ/Тритон 1/2, моль/моль). Оставляют в холодильнике на 15-30 мин до полного просветления. Доводят объем полученных мицелл до 2,5 мл тем же буферным раствором и добавляют 86 мкл 0,1 М 2 Исходный раствор метгемоглобина добавляется в количестве 21,5 нмоль. Конечный объем реакционной смеси - 4,3 мл. Реакционную смесь по 2 мл помещают в парные сухие кюветы (длина оптического пути 1 см) и регистрируют на Спекорде - нулевую линию. Реакция начинается добавлением в опытную кювету сыворотки в объеме 20 мкл. В контрольную кювету добавляется такое же количество буферного раствора. Спектры пропускания регистрируют на Спекорде - в режиме пропускания (регистр Т 75-125 ). Пересчет единиц пропускания (Т) в единицы поглощенияпроводят по формуле 2-(100 -/3) (фиг.1). На фиг. 1 представлена зависимостьот времени экспозиции с метгемоглобином и количества вносимой сыворотки. На фиг. 1 А представлен типичный спектр поглощения, регистрируемый при добавлении к реакционной смеси, содержащей, помимо субстрата, метгемоглобин, ионы Са 2 и 0,05 М Трис-, 8,0 - буферный раствор, 10 мкл сыворотки крови человека. Видно, что разница между максимумом и минимумомнарастает с течением времени реакции (экспозиции с сывороткой). На рисунке 1 В представлена калибровочная кривая по оси ординат обозначена активность фермента, выраженная в единицах поглощения , по оси абсцисс - объемы проб, которые показывают прямо пропорциональную зависимость. Условия реакции ФХ 0,12 мМ,5 мкМ, Са 22 мМ,20 С. Время реакции - 5 мин. Для подтверждения корректности определения фосфолипазной активности гемопротеидным методом параллельно в том же образце сыворотки крови наличие данной актив 4 12552 1 2009.10.30 ности определяли традиционным методом с использованием ТСХ для разделения продуктов реакции, представленном в примере 2. Пример 2. Определение активности ФЛА 2 в сыворотке крови традиционным методом с использованием ТСХ для разделения продуктов реакции. Реакцию проводят с использованием в качестве субстрата мицелл, содержащих яичный фосфатидилхолин (ФХ) и анионный детергент холат натрия (соотношение 13,мольмоль). В качестве контроля используют смесь того же образца мицелл, содержащую ионы кальция и буферный раствор той же концентрации, что и в опыте. По истечении выбранного времени реакции (24 ч) продукты гидролиза фосфолипида разделяют методом ТСХ, экстрагируют хлороформ-метанольной смесью и анализируют на наличие неорганического фосфора по методу Васьковского, после чего рассчитывают степень гидролиза исходного фосфолипида (в процентах) и активность ФЛА 2 в опытном образце, содержащем сыворотку (фиг. 2). На фиг. 2 представлен гидролиз ФХ в мицеллярной фазе, сформированной холатом натрия (13), под воздействием сыворотки крови здорового донора и крови больного острым панкреатитом. Условия проведения реакции сохраняют следующие ФХ 0,51 мМ, Са 22 мМ, комн. Реакционная смесь объемом 2,2 мл содержала 0,8 мл сыворотки. Установлено, что активность ФЛА 2 сыворотки крови (800 мкл) через 24 ч составляет 7,5 . Однако чувствительности данного метода недостаточно, чтобы достоверно зафиксировать фосфолипазную активность в сыворотке донора через 20 ч от начала реакции. В то же время гемопротеидный метод позволяет детектировать активность за этот промежуток времени в 20 мкл реакционной смеси данного образца Т 41 мм, что соответствует 0,0638 Определение активности ФЛА 2 в одних и тех же образцах сыворотки крови обоими методами показали, чтомкмоль/мл мкмоль/ мин / мг 0,0284 - 0,037 3,63 0,0442 - 0,045 3,26 0,072 - 0,053 3,07,т.е. в среднем , равное 0,05, соответствует активности фермента в общепринятых единицах - 3,32 мкмоль мин-1 мг-1 белка. Пример 3. Калибровочная зависимость для модельного эксперимента. В качестве стандарта выбрана пальмитиновая кислота, поскольку ее концентрация преобладает в составе фосфолипидов сыворотки крови и ФХ из яичного желтка, используемого нами в качестве субстрата. На фиг. 1 представлена зависимостьот концентрации пальмитиновой кислоты (ПК). На фиг. 3 представлена зависимостьот концентрации пальмитиновой кислоты (ПК) в условиях ФХ 0,12 мМ,5 мкМ,Са 22 мМ. Калибровочная кривая по пальмитиновой кислоте показывает высокую степень линеаризации и, таким образом, может служить для расчета активности фермента в модельных экспериментах, включающих в состав реакционной среды фермент (ФЛА 2),кофактор (Са 2), субстрат (фосфолипид) и индикатор . Источники информации 1. Брокерхоф ., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М. Мир, 1978. - 278 с. 2. Остапенко О.В., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Биоорганическая химия. 1986. - Т. 12. -11. - С. 1445-1465. 3. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А 2. Структура и функция. Минск Навукатэхнка,1991. - 270 с. 4. Брагина Н.А., Чупин В.В., Булгаков В.В., Шальнев А.Н. Биоорганическая химия. 1999. - Т.25. -2. - С. 83-96. 5 12552 1 2009.10.30 5..,.,. . . . - 1974. - . 2. - . 177204. 6..,.. . . - 1981. - . 116. - . 553-558. 7.Т.,1,, . . - 1988. . 170. - . 248-255. 8..-.,.-., . - 1988. - . 172. - . 397-402. 9. Асатиани Ферментные методы анализа. - М. Наука, 1969. - С.490. 10. Кисель М.А., Литвинко Н.М. Химико-фармацевтический журнал. - 1995. -6. С. 19-22. 11.,,.17 ... . / . . . .// . . - 1997. .11. -9. - 2623. - . 1306. 12. СССР 1364634, МПК 4 С 12 9/16, 1988. 13. Скоростецкая Л.А., Головач О.А., Таганович А.Д., Литвинко Н.М. // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистемПод ред. И.Д. Волотовского и др., 2006. - Т - С. 249- 251 (прототип). 14..,С.,,,2-// .. 2001. - .42. - . 1706-1713. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6