Ингибитор коронавируса и способ подавления репродукции коронавируса

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ИНГИБИТОР КОРОНАВИРУСА И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ КОРОНАВИРУСА(71) Заявители Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Бореко Евгений Иванович Павлова Наталья Ильинична Савинова Ольга Владимировна Савельева Тамара Александровна(73) Патентообладатели Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского. - .10,4. - . 581-586.2234313 1, 2004. Информационный экспресс-бюллетень. Коронавирус- возбудитель атипичной пневмонии Временные методические рекомендации. Москва, 2003. С. 27... //. - 2005. - .326, 4. - . 905-908.(57) 1. Применение комбинации метронидазола и рибавирина для подавления репродукции коронавируса в культуре клеток. 2. Способ подавления репродукции коронавируса в культуре клеток, включающий внесение в среду культивирования рибавирина, отличающийся тем, что вносят рибавирин до концентрации 12,5 мкг/мл и дополнительно метронидазол до концентрации 6200 мкг/мл. Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть использовано для подавления размножения коронавирусов и редукции вызываемых ими заболеваний. Среди лекарственных препаратов, разрешенных к применению, наиболее выраженным противокоронавирусным действием, по данным экспериментов, обладает рибавирин 1, 2, 3, 4. Рибавирин обладает широким спектром противовирусного действия в отношении различных оболочечных вирусов и является единственным противовирусным средством, применявшимся для лечения больных . Противовирусная активность ри 12645 1 2009.12.30 бавирина недостаточна для проявления клинически заметного эффекта при инфекции, вызванной -коронавирусом 5, 6, 7, 8, 4. Известен способ подавления репродукции коронавируса, регистрируемой по его цитопатическому действию (ЦПД), заключающийся в использовании рибавирина в составе среды поддержки культуры клеток в концентрации 0,5-5 мг/мл 3. Недостатком способа является необходимость применения препарата в концентрациях, превышающих концентрации, оказывающие цитотоксическое действие на неинфицированную культуру клеток(0,2-1 мг/мл). Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противокоронавирусным действием, и увеличение эффективности рибавирина. Поставленная задача достигается в применении комбинации метронидазола и рибавирина для подавления репродукции коронавируса в культуре клеток и способе подавления репродукции коронавируса в культуре клеток, включающем внесение в среду культивирования рибавирина, при этом вносят рибавирин до концентрации 12,5 мкг/мл и дополнительно метронидазол до концентрации 6-200 мкг/мл. Метронидазол является официнальным лекарственным препаратом и предназначен для лечения протозойных инфекций (трихомониаза, лямблиоза, амебной дизентерии) 9. Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить метронидазол в качестве ингибитора репродукции коронавируса. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1 Токсическое действие метронидазола для культуры клеток. Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток СПЭВ отмывают от ростовой среды и наносят растворы метронидазола на среде поддержки (среды 199 и Игла в соотношении 11) с концентрацией 800-12,5 мкг/мл. По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив 10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне концентраций от 200 мкг/мл и более низких метронидазол не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 2 Токсическое действие рибавирина для культуры клеток. Исследование, описанное в примере 1, выполняют с рибавирином. Устанавливают,что в диапазоне концентраций от 800 мкг/мл и более низких рибавирин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 3 Противовирусное действие метронидазола. При проведении исследований используют культуру клеток СПЭВ, среды 199 и Игла в соотношении 11 в качестве среды поддержки, коронавирус свиней (штамм Пурдью), метронидазол (0,5 раствор для инфузий производства РУП Белмедпрепараты). Монослойные культуры клеток СПЭВ отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса в пределах 0,01-0,00001 ТЦИД 50/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают средой поддержки с растворенным в ней метронидазолом в различных концентрациях. Флаконы помещают в термостат на 48 ч и затем учитывают выраженность цитопатического действия (ЦПД) вируса при малом увеличении микроскопа. Вычисляют титр вируса и концентрации метронидазола, в присутствии которых титр снижается на 50(среднеэффективная концентрация, ЕС 50) и на 95(95). Диапазон концентраций метронидазола с противовирусным действием выражают в виде отношений максимально переносимой концентрации (МПК) к 50 (отношение МПК/ЕС 50) и МПК к 95 (отноше 2 12645 1 2009.12.30 ние МПК/95, индекс селективности). МПК соединений для неинфицированной культуры клеток определяют после 72 часов инкубации. Полученные результаты приведены в таблице. Как видно, метронидазол обладает некоторой способностью тормозить репродукцию коронавируса. Его среднеэффективная концентрация (50) составляет 0,26 мкг/мл, индекс селективности (МПК/ЕС 95) равен 0,3. Пример 4 Противовирусное действие рибавирина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с рибавирином. Полученные результаты приведены в таблице. Как видно, рибавирин обладает выраженной способностью тормозить репродукцию коронавируса и является высокоактивным противовирусным средством. В сравнении с метронидазолом его среднеэффективная концентрация (ЕС 50) более высока, однако противовирусное действие характеризуется резким снижением титра коронавируса на величину 95 и более в широком диапазоне концентраций. В результате индекс селективности (МПК/ЕС 95) рибавирина равен 76,5. Пример 5. Способ подавления репродукции коронавируса с использованием метронидазола и рибавирина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями метронидазола и 12,5 мкг/мл рибавирина с целью определить 50 и 95 метронидазола. Полученные результаты приведены в таблице. Как видно, в присутствии метронидазола в диапазоне концентраций 200-6 мкг/мл и 12,5 мкг/мл рибавирина имеет место существенное подавление репродукции коронавируса на величину более 1 ТЦИД 50/мл (более 90 ). 50 метронидазола в присутствии 12,5 мкг/мл рибавирина составляет 0,021 мкг/мл, что свидетельствует об увеличении противовирусного действия препарата в 12,4 раза (вычислено делением значения 50 метронидазола без рибавирина на 50 препарата в присутствии рибавирина). Увеличение противовирусной активности метронидазола в присутствии рибавирина по индексу селективности составляет 38 раз. Пример 6 Способ подавления репродукции коронавируса с использованием рибавирина и метронидазола. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями рибавирина и 100 мкг/мл метронидазола с целью определить 50 и 95 рибавирина. Полученные результаты приведены в таблице. Подавление репродукции коронавируса в культуре клеток СПЭВ в присутствии метронидазола , рибавиринаи их сочетаний Разность 50/95 (95) Шифр Концен- Титр виМПК/ЕС 50/МПК/ЕС 9 с контровеще- трация, руса х,лем,мкг/мл М 5 ства мкг/млБОЕ/млБОЕ/мл 400 3 2,18 0,26 769,2 200 4,100,49 1,08 12 12645 1 2009.12.30 Продолжение таблицы Разность Шифр Концен- Титр вис контровеще- трация, руса х,лем,ства мкг/млБОЕ/мл БОЕ/мл 800 3 2,18 400 3 2,18 200 3 2,18 100 3 2,18 Как видно, в присутствии рибавирина в диапазоне концентраций 200-3 мкг/мл и 100 мкг/мл метронидазола имеет место существенное подавление репродукции коронавируса на величину 2,5 ТЦИД 50/мл и более (99,7 и более). 50 рибавирина в присутствии 100 мкг/мл метронидазола составляет 0,0001 мкг/мл, что свидетельствует об увеличении противовирусного действия препарата в 73 800 раз (вычислено делением значения ЕС 50 рибавирина без метронидазола на 50 препарата в присутствии метронидазола). Увеличение противовирусной активности метронидазола в присутствии рибавирина по индексу селективности составляет 23,8 раза. Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При использовании метронидазола удается получить подавление репродукции коронавируса в культуре клеток. Противокоронавирусная активность рибавирина, если судить по среднеэффективной концентрации, уступает метронидазолу в 28,4 раза. Однако рибавирин обладает более высокой степенью снижения репродукции вируса и по индексу селективности его активность превосходит противовирусные свойства метронидазола в 255 раз. При сочетанном использовании метронидазола и рибавирина возрастает противокоронавирусное действие обоих препаратов. При оценке по среднеэффективной концентрации активность метронидазола увеличивается в 12,4 раза, рибавирина - в 73 800 раз при оценке по индек 4 12645 1 2009.12.30 су селективности активность метронидазола увеличивается в 38 раз, рибавирина - в 23,8 раза. Значение фракционального индекса ингибирования (ФИИ), рассчитанное по формуле ФИИ 50 в-ва А в комбинации/ЕС 50 в-ва А в отдельности 50 в-ва Б в комбинации/ЕС 50 в-ва Б в отдельности ( С.,., 1982) 10, составляет 0,08. Оно свидетельствует о крайне выраженном синергизме комбинированного использования препаратов. Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции коронавирусов и редукции вызываемых ими заболеваний. Существенным моментом заявляемого решения является высокая липотропность метронидазола, благодаря чему этот препарат очень хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер, а также другие системы организма, выполняющие барьерную функцию на разделе сред. Одной из таких систем является сурфактант легких, представляющий собой липидно-протеиновый комплекс на поверхности альвеолярного эпителия. Основным свойством легочного сурфактанта является способность снижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз между альвеолярным эпителием и воздухом в альвеолярном пространстве. Это позволяет дыхательной мускулатуре обеспечивать цикл вдох-выдох. Недостаток сурфактанта и нарушение его образования вызывает спадение стенок альвеол(ателектаз) и так называемый респираторный дистресс-синдром, являющийся одной из основных причин младенческой заболеваемости и смертности. Острые респираторные вирусные инфекции, к которым относятся также и заболевания, вызываемые коронавирусами, в частности , сопровождаются очаговым ателектазом, респираторным дистресс-синдромом или пневмонией 11, связанными с нарушением образования сурфактанта. Поскольку метронидазол может легко проникать в липидную составляющую сурфактанта, его применением решается вопрос транспорта ингибитора репродукции коронавируса в непосредственное окружение очага инфекции. Эта особенность фармакодинамики метронидазола может быть позитивным этиопатогенетическим моментом, дополняющим экстремальное увеличение противовирусной активности метронидазола и рибавирина при совместном использовании. Учитывая, что метронидазол, как и рибавирин, является лекарственным препаратом,разрешенным к применению, на основе заявляемого решения возможно его использование в комплексной терапии коронавирусных инфекций. Ожидается высокий эффект комбинированного применения метронидазола и рибавирина при . Для выработки окончательных рекомендаций по применению метронидазола и рибавирина с этой целью необходимы клинические испытания и отработка оптимальных схем применения. Источники информации 1..,,.,,,,,, ,,.,,10. . . . - 2004.- . 31(1). - . 6975. 2.,,,,,,,, ,.,,/. . - 2004. - . 59(3). - . 252-256. 3.,,,.С.,,В.,. . . . 2004. - . 10(4). - . 584. 4... - 2003. . 169(11) - . 1165-1166. 5. - 2004. - . 9(8). - . 923-927. 7.Т.,.,.. . . . . - 2004. - . 128(12). - . 1346-1350. 8.В.,.,,,-. . . . . - 2005. - . 326(4). - . 905-908. 9. Лекарственные средства Пособие для врачей, ч. , 12-е изд., М. Медицина, 1993. С. 390-391. 10.С.,.// . . - 1982. - . 73. - . 135-143. 11. Инструкция по эпидемиологии, клинике, диагностике, лечению случаев тяжелого острого респираторного синдромаи организации профилактических и противоэпидемических мероприятий. Утв. приказом Минздрава РБ 64 от 08 апреля 2003. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6