Применение тардиферона для подавления репродукции ВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ ТАРДИФЕРОНА ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Кучеров Игорь Иванович Подольская Ирина Александровна Мистрюкова Любовь Олеговна Коржев Михаил Олегович Абаев Аркадий Юрьевич Рытик Петр Григорьевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56)95/35113 А 1. Рытик П.Г. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека. Материалынаучно-практической конференции. - Минск, 2001. - С. 201-207. Кучеров И.И. и др. Инфекция и иммунитет. Материалы, приуроченные кМеждународному форуму по глобальной вакцинологии Вакцины и иммунизация. - Минск, 2001. - С. 141-146.(57) Применение тардиферона в качестве препарата, подавляющего репродукцию ВИЧ в Т-лимфобластоидных клетках. Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для решения задачи профилактики и лечения ВИЧ-инфекции/СПИДа. В настоящее время основной стратегией лечения ВИЧ-инфекции/СПИДа является комбинированное применение этиотропных лекарственных средств 1, подавляющих репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) за счет прямого воздействия на его ферменты, участвующие в этом процессе (обратную транскриптазу и протеазу), в частности азидотимидин (АЗТ) 2. Однако все, без исключения, используемые для этой цели лекарственные средства имеют ряд ограничений для своего применения. Во-первых,высокая стоимость комбинированной этиотропной терапии (до 10 тысячв год на 1 пациента) делают ее труднодоступной для населения большинства развивающихся стран 3, к которым относится и Беларусь. Так, стоимость 30-дневного курса лечения лишь одним препаратом АЗТ (цена 1 таблетки 2,32 доллара США) составляет около 418 долларов США. Во-вторых, все эти препараты обладают выраженным побочным действием и трудно переносятся пациентами 1. Так, применение нуклеозидных ингибиторов ВИЧ, представителем которых является АЗТ, способно вызывать такие побочные эффекты, как нейтропения, анемия, панкреатиты, периферическая нейропатия, афтозные язвы, диаррея и др. И,наконец, третье - эффективность применения АЗТ (и других нуклеозидных ингибиторов ВИЧ) уже спустя несколько месяцев существенно снижается вследствие селекции АЗТ 7675 1 2006.02.28 резистентных вариантов ВИЧ 4. Известно также, что формирующаяся у ВИЧ резистентность к одному из нуклеозидных препаратов может носить перекрестный характер 5. Задача изобретения поиск новых ингибиторов ВИЧ среди уже используемых в медицинской практике лечебных препаратов другого назначения, доступных по цене, без ярко выраженных побочных действий и активных в отношении резистентных к нуклеозидным ингибиторам штаммов ВИЧ. Результат достигается применением тардиферона для подавления репродукции ВИЧ. Препарат содержит 80 мг сульфата железа, 80 мг мукопротеозы, являющейся природной высокомолекулярной фракцией слизистой оболочки кишечника животных со строго определенной долей аминосахаров, и аскорбиновую кислоту в качестве антиоксиданта. Противопоказания практически отсутствуют, побочных явлений не наблюдается. Производитель Робафарм (Базель, Швейцария). Цена упаковки из 30 драже на 01.09.02 - 8220 бел. руб. (274 бел. руб. за 1 драже). Для профилактики назначается 1 драже в сутки. Стоимость 30-дневного применения препарата составляет около 5 долларов США. Новизна изобретения заключается в обнаружении у Тардиферона новых биологических свойств в виде подавления репродукции ВИЧ в культуре клеток. Оригинальность изобретения в установлении наличия у широко применяемого в медицине при железодефицитных состояниях противоанемического средства новой функции способности тормозить репликацию ВИЧ в инфицированных клетках. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Определение анти-ВИЧ активности Тардиферона методом формазанового теста (ФТ). Эксперименты проводились на трех Т-лимфобластоидных клеточных линиях .,-3 и МТ-4. Инфекционным агентом служил выделенный в Беларуси от вирусоносителя высокорепликативный штамм ВИЧ-с инфекционным титром не менее 6,0 ТЦД 50. Испытания проводили на двух клонах вируса АЗТ-чувствительном (-) и АЗТрезистентном . Постановку ФТ проводили в двух модификациях а) профилактической, когда ВИЧ вносили в клеточную культуру через 2 часа после контакта клеток с препаратом б) терапевтической - при одновременном внесении препарата и вируса. Суть метода заключается в том, что после добавления в культуру реагентаживыми клетками адсорбируется образующийся формазановый продукт, степень накопления которого после растворения в органическом инградиенте (ДМСО), измеряется на спектрофотометре при длине волны 540 нм. О наличии анти-ВИЧ активности препарата судили на 5-е сутки после заражения клеток по индексу защиты (ИЗ) клеток. Показатель ИЗ выше 50 указывал на наличие ингибирующего эффекта. Исходный раствор препарата (5 мкг/мл) готовилина дистиллированной воде, после чего его титровали в лунках 96-луночной панели и вносили клетки и вирус, согласно выбранному протоколу ФТ. В результате испытаний установлено, что при использовании (-) клона ВИЧ- анти-ВИЧ активность Тардиферона отмечена при концентрациях 50,0-0,4 мкг/мл, а в случаеклона ВИЧ-1 - 50,0-2,0 мкг/мл. Препарат защищал клетки от цитопатического действия ВИЧ как в терапевтической, так и профилактической схемах испытаний. Кроме того, отмечена слабая токсичность препарата для испытуемых клеток его химиотерапевтический индекс составил 300. Пример 2 Оценка анти-ВИЧ активности Тардиферона по прижизненной окраске клеток трипановым синим . Испытания проводились на Т-лимфобластоидных клеточных линиях -3 и МТ-4 в аналогичных с ФТ условиях. Результаты теста учитывались на 5-е сутки путем прижизненной окраски клеток 0,2 раствором трипанового синего ( ). Методика позволяет непосредственно судить о количестве живых (неокрашенных) и мертвых 2(окрашенных в синий цвет) клеток, подсчитываемых в камере Горяева под световым микроскопом Ломо АУ-12 (ув. 1,5720). Об эффективности препарата судили по величине 50 ( ), при которой число живых клеток, обработанных препаратом и инфицированных ВИЧ, на 50 превышало их число в контроле вируса. В результате установлено, что Тардиферон защищал клетки от вирулицидного действия ВИЧ-1, причем его 50, независимо от использования (-) либоклонов,располагались в диапазоне концентраций 50,0-10,0 мкг/мл. Пример 3 Ингибирование синцитиеобразующей активности (ИСА) ВИЧ. Испытания проводили на двух Т-лимфобластоидных клеточных линиях СЕМ. и -3 с использованием синцитиеобразующего штамма ВИЧ-1. Учет результатов проводили на 5-е сутки после заражения клеток путем подсчета синцитиев на 30 полях зрения в инвертированном микроскопе -(ув.1010/.25). Позитивными считались те концентрации препарата, при которых количество синцитиев было снижено не менее 25 по сравнению с контролем вируса. В результате испытаний установлено, что концентрации Тардиферона 100,0-50,0 мкг/мл подавляли синцитиеобразование, индуцированное ВИЧ-1, на 80-88 . Пример 4 Подавление накопления внутриклеточных антигенов ВИЧ-1 в инфицированных клетках по данным непрямой иммунофлуоресценции (НИФ). Испытания препарата проводили на Т-лимфобластоидных клетках МТ-4 с использованием (-) иклонов ВИЧ-1. Учет результатов проводили на 3-и сутки после инфицирования клеток путем фиксации их на предметных стеклах с последующей обработкой поликлональной ВИЧ-позитивной сывороткой и меченным люминесцентным красителем (ФИТЦом) конъюгатом с добавлением красителя - для устранения неспецифического свечения. Просмотр полученных препаратов осуществляли под люминецентным микроскопом Люмам ИЗ (ув. МИ 901,25). Об эффективности препарата судили по его 50 - таких концентраций, при которых число специфически светящихся, т.е. инфицированных клеток, было на 50 меньше, чем в контроле вируса (клетках, не обработанных препаратом). О результатах судили путем подсчета 200 клеток из каждого разведения испытуемого препарата. В результате установлено, что в диапазоне концентраций 50,0-0,4 мкг/мл Тардиферон подавляет накопление внутриклеточных вирусных антигенов (-) иклонов ВИЧ-1. Суммарные данные оценки ингибирующего действия Тардиферона на ВИЧ различными методами приведены в таблице. Табл. Результаты испытаний препарата Тардиферон различными методами на анти-ВИЧ активность Таким образом, выявлен лекарственный препарат, подавляющий репродукцию ВИЧ в культивируемых Т-лимфобластоидных клетках. Как видно из примеров 1-4 (см. таблицу),Тардиферон защищает более 50 клеток от цитопатического действия ВИЧ-1 и препятствует накоплению вирусных антигенов в цитоплазме зараженных клетках, что позволяет рассматривать его в качестве препарата, обладающего анти-ВИЧ свойствами, в том числе и в отношении АЗТ-резистентногоклона ВИЧ-1. 3 7675 1 2006.02.28 Источники информации 1..,.//.3, 2002. - . 3. 2..-,.-.,.-..////, ,, 1990. - . 616. - . 218. 3.Международная конференция по СПИДу, Дурбан (ЮАР) // Русский ж-л ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2000 . - Т. 4,2. - С. 9. 4. Папуашвили Подходы к терапии ВИЧ-инфекции//Русский ж-л ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2001. - Т. 5. -2. - С. 92. 5.М.А.,.,..--1//- , ,/1990. . 616. - . 349. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.