Способ получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью

61 31/725 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(71) Заявители Институт биохимии НАН Беларуси, Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета им. В.И.Ленина(73) Патентообладатели Институт биохимии НАН Беларуси, Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета им. В.И. Ленина(57) Способ получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью, путем сорбции окситиамина на полиангидроглюкороновой кислоте, отличающийся тем, что связанный окситиамин дополнительно обрабатывают раствором метотрексата при массовом соотношении окситиаминметотрексат, равном 1,00,016, с последующим высаждением целевого продукта органическим растворителем.(56) 1. Химико-фармацевтический журнал, 1991, 1.-С. 4-7 (прототип). Изобретение относится к биохимии, в частности к витаминологии и экспериментальной онкологии, и может быть использовано в экспериментальной практике. Известен способ получения препарата-окситиамина, обладающего антивитаминной активностью, путем дезаминирования тиамина в кислой среде 1 (Экспериментальная витаминология / Под ред. Ю.М.Островского.- Минск, 1979.-С. 219.) Окситиамин является антагонистом тиамина (витамина В 1) и при парентеральном введении в организм ингибирует активность тиаминзависимых ферментов в крови и различных органах (Островский Ю.М. Антивитамины в экспериментальной и лечебной практике.- Минск, 1973.- С. 142-158). Кроме того, окситиамин хорошо зарекомендовал себя в экспериментальных исследованиях, обнаружив высокую антибластомную активность в отношении многих штаммов опухолей (Требухина Р.В., Михальцевич Г.Н. // Экспериментальная онкология, 1982.-Т.4.-6.-С. 39-43 Зиматкина Т.И., Опарин Д.А., Величко М.Г. и др. // Доклады АН БССР,1986.-Т.30.-9.-С. 850-852 Опарин Д.А., Забродская С.В. // Экспериментальная онкология, 1992.-Т.14.-4.С. 74-77). Достоинствами данного антиметаболита являются непроницаемость его через гематоэнцефалический барьер, меньшая по сравнению со многими известными цитостатиками токсичность (см. Островский Ю.М. Антивитамины в экспериментальной и лечебной практике. Минск. 1973. С.142-158). Известен также способ получения окситиамина путем гидролиза бромистоводородной соли тиамина в присутствии бромистоводородной кислоты (Опарин Д.А., Зиматкина Т.И., Островский Ю.М. // Вопр. мед. химии, 1987.-Т.33.-1.-С. 70-71). Недостатком окситиамина, полученного по известному способу, является низкое сродство его к тиаминпирофосфокиназе, слабое связывание тканями и быстрое выведение из организма (Островский Ю.М. Активные центры и группировки в молекуле тиамина.- Минск, 1975.-С. 140-209), в связи с чем препарат приходится вводить животным часто и в больших дозах. Наиболее близким по совокупности признаков и получению требуемого технического результата (прототипом) к заявленному изобретению является способ получения препарата, обладающего антивитаминной активностью, путем сорбции окситиамина полиангидроглюкуроновой кислотой 1. Иммобилизация окситиамина на 2462 1 полиангидроглюкуроновой кислоте в определенном интервале концентрации антивитамина на полимерной матрице приводит к увеличению срока его специфического действия в организме. Максимальный антивитаминный эффект достигается при применении препарата с содержанием окситиамина 140-200 мг/г носителя. Препарат с лабораторным шифром АТ-10-4 (содержание окситиамина 141 мг/г полиангидроглюкуроновой кислоты), полученный по известному способу, обладает также и противоопухолевым действием (Зиматкина Т.И., Зиматкин С.М., Титова С.П., и др. Доклады АН Беларуси 1992.-Т.36.- 6.-С. 552-557). Недостатком известного способа является то, что полученный препарат при однократном введении его в организм животного обладает недостаточно сильным и длительным канцеростатическим действием. Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в получении препарата, обладающего более высоким притивоопухолевым и антивитаминным действием. Указанная задача решается тем, что в известном способе получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью, путем связывания окситиамина с полиангидроглюкуроновой кислотой, согласно изобретению, связанный с полиангидроглюкуроновой кислотой окситиамин, дополнительно обрабатывают раствором метотрексата с последующим высаждением целевого продукта органическим растворителем. Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением положительного эффекта при использовании всей совокупности признаков изобретения, указанной в его формуле. Пример 1. К 2 г. полиангидроглюкуроновой кислоты приливают 18 мл водного раствора, содержащего 800 мг гидроокиси натрия (14, отношение массы полиангидроглюкуроновой кислоты к объему раствора 19), тщательно перемешивают в течение 2-х часов, добавляют 1 н раствор соляной кислоты до 6,5. К полученной смеси приливают 20 мл водного раствора, содержащего 1 г окситиамина (весовое отношение окситиаминполиангидроглюкуроновая кислота 12), выдерживают в течение 2-х часов при постоянном перемешивании и приливают 35 мл ацетона. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают ацетоном, эфиром и высушивают на воздухе. Затем готовят раствор метотрексата. Для этого берут 10 мл физиологического раствора (0,9 ) и растворяют 5 мг метотрексата. Приготовленным раствором, содержащим 5 мг метотрексата, обрабатывают, связанный с полиангидроглюкуроновой кислотой, окситиамин методом простого смешивания (весовое отношение окситиаминполиангидроглюкуроновая кислотаметотрексат 1,06,250,016). Полученную смесь выдерживают в течение 2-х часов при постоянном перемешивании и приливают 10 мл ацетона. После этого образец переносят на воронку Бюхнера, промывают ацетоном, эфиром и высушивают при комнатной температуре до воздушного состояния. Содержание окситиамина и метотрексата в образце составляет соответственно 160 мг/г и 0,6 мг/г. Исследования биологической активности заявляемого препарата проводили на беспородных белых мышах-самках массой 18-21 г с быстрорастущими, высокозлокачественными опухолями. Асцитный рак Эрлиха (АРЭ) прививали животным внутрибрюшинно, а саркому 180 (С-180) подкожно от мышей доноров по общепринятым методикам (Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии / Под ред. Г.Н.Першина.-М., 1971.-С. 357-382). Через сутки после прививки опухолей контрольным животным вводили однократно подкожно персиковое масло, а мышам опытных групп заявляемый препарат (лабораторный шифр АТ-10-11) с дозами окситиамина (ОТ) и метотрексата (МТ) 2000,75 мг/кг. Мышей с АРЭ декапитировали на 5,9 и 12-е, а с С-180 на 5, 10 и 15-е сутки после прививки опухоли, что соответствовало начальному, интенсивному и терминальному периодам роста неоплазмы у контрольных животных(Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов.-М., 1977.-С. 45-134). Асцитную жидкость у животных с АРЭ собирали в пробирки с гепарином, опухолевые клетки отделяли низкоскоростным центрифугированием (1500 об/мин). Измеряли объем асцита и осадка опухолевых клеток у мышей с С 180 определяли массу опухоли. На основании полученных данных и значений средней массы тела животных в группах к концу определяемого срока рассчитывали индексы торможения роста неоплазмы (т), коэффициенты противоопухолевой активности (Ка) и индексы эффективности препаратов (э) (Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов.-М., 1977.-С. 45-134 Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии / Под ред. Г.Н.Першина.-М., 1971.-С. 357-382). Определяли митотическую активность онкоцитов. Для этого в случае АРЭ каплю асцитной жидкости от каждого животного использовали для приготовления мазков, которые подсушивали на воздухе, фиксировали метанолом, окрашивали гематоксилином и эозином, обезвоживали и помещали в полистирол. В каждом препарате обсчитывали не менее 1000 клеток, исключая из подсчета клетки крови и мезотелия. В качестве показателя пролиферативной активности онкоцитов использовали митотические индексы (МИ), подсчитывая количество митотически делящихся клеток на 1000 из общего числа подсчитанных онкоцитов. В отдельном эксперименте исследовали время жизни животных, рассчитывали среднюю продолжительность и показатели времени жизниопытных мышей по сравнению с контрольными. (см. Эмануэль Н.М. Кинетика эксперимен 2 2462 1 тальных опухолевых процессов.-М., 1977.-С. 35). Сравнительную количественную оценку эффективности противоопухолевого действия соединений проводили комплексно на основании всех перечисленных выше показателей, а также на основании сроков жизни опухоленосителей. Результаты расчетов сведены в таблицы 1 и 2. В таблицах 1 и 2 приведены данные исследований препарата, полученного по заявляемому способу (лабораторный шифр АТ-10-11), в сравнении с контролем, прототипом (лабораторный шифр АТ-10-4 окситиамин, связанный с полиангидроглюкуроновой кислотой) и сочетанным использованием АТ-10-4 и МТ. Среднее время жизни мышей контрольной группы с С-180 составило 20,80,5 сут., а с АРЭ-13,80,5 сут. При применении АТ-10-11 срок жизни опухоленосителей возрастал в 2,3-3,2 раза и был выше, чем в случае использования АТ-10-4 или его комбинации с МТ (табл.1). АТ-10-11 более значительно, в сравнении с прототипом и сочетанным применением АТ-10-4 и МТ,подавлял процесс деления опухолевых клеток. МИ препарата был соответственно в 6 и 4 раза ниже, чем у АТ-10-4 или комбинации АТ-10-4 с МТ (табл.1). Сопоставление силы и длительности антибластомного действия препаратов по величинам т и Ка (табл.2) говорит о том, что полученный препарат обладает выраженными пролонгированными противоопухолевыми свойствами и вызывает значительное торможение роста обоих опухолевых штаммов, особенно с 1-х по 10-е сутки. Анализ противоопухолевого действия препаратов по величине э, как критерию, учитывающему также увеличение времени жизни опухоленосителей, указывает на большую эффективность АТ-10-11 и по этому критерию. Установлено, что исследуемое соединение вызывало ингибирование транскетолазы в опухолевой и других тканях животных. В таблице 3 представлена динамика изменения активности данного фермента в опухоли, крови и печени мышей с АРЭ после введения им соединений. Самое сильное угнетение транскетолазы наблюдалось в опухолевой ткани, затем шла кровь, для которой также характерно наличие апоформы фермента. Значительно меньшие эффекты были отмечены в печени и других тканях, то есть ингибирование транскетолазы в опухоли под действием ОТ и его аналогов, как видим, превалировало над другими тканями. АТ-10-11 вызывал более значительное, в сравнении с прототипом или сочетанным применением АТ-10-4 и МТ, угнетение активности фермента в злокачественных клетках (табл.3). Обнаружена сильная прямая связь между степенью ингибирования транскетолазы в опухоли и канцеростатическим действием препарата. Показано, что величины т, Ка и э АТ-10-11 изменяются симбатно со степенью угнетения им активности фермента в неоплазме (коэффициенты корреляции составили соответственно 0,998 0,996 и 0,966). Высокие статистические показатели выявленной корреляционной зависимости свидетельствует о том, что антитиаминовое действие соединения (в частности ингибирование транскетолазы) является одним из определяющих в механизме его антибластомного действия. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что новый комбинированный препарат, полученный заявляемым способом, более эффективен как противоопухолевое и антивитаминное средство в сравнении с прототипом, а также сочетанным применением АТ-10-4 и МТ, т.к. проявляет более сильную антитиаминовую и канцеростатическую активность при минимальном токсическом воздействии на организм опухоленосителей. Таблица 1 Показатели времени жизни животных-опухоленосителей (1 , 2 ) и митотические индексы он коцитов (МИ, 9-е сут.) после введения соединений Препараты 2462 1 Таблица 2 Параметры противоопухолевого действия соединений Ка,2462 1 Таблица 3 Величины приведенной активности транскетолазы (нмоль седугептулозо-7-фосфата/мл крови или мг ткани/мин) у мышей с АРЭ после введения соединений Препараты Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.