Способ получения гонадотропина, обладающего активностью фолликулостимулирующего гормона из постменопаузной мочи (мочевого концентрата)

Введение путем подкожной инъекции могло бы позволить осуществить самовведение пациентам и, следовательно, повысить содействие и готовность пациентов в лечении.Однако подкожное введение может сопровождаться таким недостатком, как местная аллергия, вследствие наличия примесей в используемом продукте и, следовательно, может привести к приостановке лечения.Методики очистки продукта включают один или более таких способов, как хроматография на диэтилаъшноэтидщеапполозе, гельфштьтрация на Сефадекс 6-100, гидроксилапатитовая хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и подобное.Один из наиболее очищенных препаратов ФСГ был описан Ван Хеллом и др. 1.Высокая активность была достигнута путем добавления стадий иммунохроматографии и гель-фильтрации к традиционному методу хроматографической очистки. Иммунохроматографию осуществляли с использованием анти-хорионического гонадотропина человека(анти-ХГШ-антител, связанных с Сефарозой для специфической цели удаления активности ЛГ из частично очищенных фракций ФСГ. Наиболее очищенная фракция ФСГ содержала 4720 международных единиц ФСГ на т, и контаминация ЛГ составила всего 15 международных единиц ЛГ на гм, как испытано радиоиммуноанадшзом.Задача, на решение которой направлено изобретение, состояла в получении абсолютно чищдщ препарата ФСГ, когда при лечении требуется активность ФСГ при полном отсутствии активности ЛГ.В процессе создания изобретения обнаружено, что человеческий мочевой ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что полученный ФСГ совершенно свободен от любых обнаруживаемых следовых количеств ЛГ и других мочевых белков.Фармацевтическая композиция, содержащая очищенный белок в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель, находится в форме, пригодной для подкожного введения. Обнаружено, что подкожное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением не приводит к возникновению тех аллергических реакций, которые обычно сопровождают применение известных препаратов ФСГ.В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения нового и высокоочищенного ФСГ. Способ в основном базируется на комбинации стадии иммуноочистки с жидкостной хроматографией высокого давления с обращенной фазой. Стадия иммуноочи 10спи использует иммобшшзованные моноклональные антитела, однако с фундаментальным отличием, заключающимся в том, что элюирование ФСГ из иммунокомтшекса осуществляют при более высоких значениях рН.В способе настоящего изобретения элюирование удобно осуществлять с использованием водного раствора, имеющего рН выше, приблизительно, 10, и молярности выше, приблизительно, 0,5. Эксперименты, проведенные заявителем, показали. что при таких условиях иммобилизованное антитело в основном не инактивируется.Это различие в поведении может зависеть от различий в методах, приемлемых для связывания антитела с полимером.В соответствие с настоящим изобретением рН эшоента, предпочтительно, выше 11 и, более предпочтительно, составляет интервал от 11,3 до 11,7.Пршодными элюентами для использования в способе изобретения являются аммиак, диэтиламиз и такие буферы, как ТРИС-буфер,глицин-МаОН и подобное.Последующая стадия жидкостной хроматов рафии высокого давления с обращенной фазой(ЖХВД) позволяет достичь полного удаления любых загрязняющих белков.После стадии жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой ФСГ восстанавливают с использованием традиционных методшс. Для целей хранения и/или манипулирования продукт может быть лиофилизирован. Предполагают также и другие пригодные методики с целью осуществления концентрации, стабилизации или другой обработки продукта.Безусловно, что доступность постклимактерической мочи намного выше, чем доступность человеческого гипофиза. Эта относительная доступность придает яркий характер заявленному изобретению.ФСГ-специфическое моноклональное антитело для использования в способе настоящего изобретения может быть получено с применением известных приемов.В типичном примере линию клеток гибридомы 9/14 подвергают скринингу на оптимальное средство к ФСГ в Университете Кембридж. Моноклональные антитела продуцируют в среде супернатанта методикам культивирования клеток и очищают при помощи солевого фракциоиирования, используя 50 (в отношении веса к объему) Сульфат аммония, с последующей ионной хроматографией с обращенной фазой и ЖХВД гель-фильтрацией и диализом.Моиоклональное антитело, продуцируемое линией клеток 9/14 и очищенное, как описановыше, имеет следующие технические требова НИИ а) чистота белка не менее, чем 90 б) класс иммуноглобулина 1 5 (31 в) константа средства 3,5 х 108 л.моль 1 г) специфичностьд) связывающая способность с ФСГ в растворе около 1000 международных единиц ФСГ на мг МсАв.ФСГ-специфические моноклональные антитела химически связываются с Сефарозой 4 В посредством дивинилсульфона в соответствии с методом, описанным Дж. Поратом в журнале Методы в фермевтологии, 34, стр. 13-30,1974.В типичном примере 1 литр Сефарозы 4 В промывают на пористом стеклянном светофильтре вначале 5 литрами свежедистштлированной воды и затем 5 литрами 1 М раствора карбоната натрия, рН 1. Промытую Сефарозу суспендпруют в 1 литре 1 М раствора карбоната натрия (рН 11). При непрерывном перемешивании по каплям прибавляют 200 мл дивинилсульфона. Реакцию завершают в течение 70 минут при комнатной температуре и затем прекращают путем прибавления 1 н.раствора НС 1 (рН до 7,0).Активированную смолу суспендируют в 1 литре 0,25 М раствора бикарбоната натрия(рН 9,0), содержащего 2 г анти-ФСГ моноклонального антитела, с получением более, чем 90 связывания антитела с активированной смолой. Полученную иммуносмолу хранят при температуре 4 С.Следующий пример 1 иллюстрирует две стадии очистки способа настоящего изобретения,приемлемые для коммерческого ЧКГ, то есть активного ингредиента в препарате Портовая К Сероно.Следует понять, что хотя ЧКГ является предпочтительным исходным материалом в способе настоящего изобретения, последний также приемлем в отношении менее очищенных материалов, таких, как постклимактерические мочевые концентраты и тому подобное. Хорошие результаты получены с использованием в качестве исходного материала мочевого концентрата, содержащего всего 1 международную единицу ФСГ на мг.Другие варианты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными после рассмотрения следующих примеров, которые не ограничивают изобретение.ч вы чи м ч в г Г в . Цшадия мм н к н - - В - ДОЗЫ ЧКГ используют в качестве исходного материала.Иммуносмолу анти-ФСГ МсАв-ДВС-Ссфарозу уравновешивают в 0,1 М Трис-НЩ, 0,3 М Маш-буфере, рН 7,5 при температуре 4 С. Колонну нагружают определенным количеством международных единиц ФСГ (РИА), соответствующим 80-90 общей связывающей способности ФСГ.Неудерживаемые белки элюируют уравновеШИВЗЮЩИМ буфером до тех пор, пока ОП 230 элюата не станет ниже, чем 0,02.Абсорбированный мочевой ФСГ элюирутот ИЗ иммуносмольх 1 М раствором аммиака при температуре 4 С. Аммиачные элюаты, соответствующие, приблизительно, 4-х кратному объему иммуносмолы, группируют, рН доводят до 9,0, как можно скорее, при температуре 4 С путем прибавления ледяной уксусной кислоты,и раствор ультрафильтруют в аппарате Амикон (мембрана С.0.10000 дельт) и концентрируют до малого объема.Полученный раствор, доведенный до рН 5,6,загружают в колонку С 1 в с обращенной фазой(Рге Рак Шатен), которую предварительно уравновешивают 0,05 М буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/ мин, и элюат записывают при 280 нм.Очистку с использованием ЖХВД осуществляют с использованием аппарата Ргер 500 АБиологически активный, высокоочищенвьхй мочевой ФСГ элюируют градиентом изопренанола до 50 подвижной фазы. Фракции проверяют аналитической гель-проникающей хроматографией и радиоиммуноападшзом.Органический растворитель удаляют дистилляцией в вакууме при температуре 40 С, после чего раствор замораживают и лиофилизируют.Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают нескольким химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Как указано ниже, большинство испытаний осуществляют в сравнении с высокоочищеиныь пре ИЯВЪ КГ В 7 ВУ 1355 С 1 аВ качестве исходного материала используют неочищенный человеческий гипофизарный экстракт (НРСЗ), побочный продукт, полученный из экстракции человеческого гормона роста.МЕТОДИКН ЗЭКЛЮЧЗВТСЯ В ОСУЦЕСТВЛНИИ СЛВ дующих стадий1) Предварительной очистки сырого НРС путем экстракции 40-нъш этанолом, содержашим 6 уксуснокислого аммония, рН 5,6 и преципитации супернатанта с помощью 96 -ного холодною этанола2) Дальнейшей очистки НРС ионообменной хроматографией на диэтнламиноэтилцешполозе с использованием 0,15 М раствора ацетата натрия, рН 7,0, в качестве элюента, с последующей прецшцитацией 96-ным холодным этанолом3) Дальнейшей очистки фракции ФСГ гельфильтрацией на Сефадексе 6-100 с использованием 0,05 М бикарбоната аммония в качестве буфера4) Последней стадии очистки ФСГ ионообменной хроматографией на колонке БР Сефацекс С 50. Высокоочищенный гипофизарньпй ФСГ эдпоируют 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 6,2 и лиофшшзируют.Как определено, биологическая удельная активность шдшщ гипофизарного ФСГ /тест Стилмана-Ролей, международная единица второго ЩР-НМО) составляет 4770 международных единиц ФСГ на мг лиофилизованвого порошка. Для этого определения используют методику, описанную ниже под заголовком Количественное определение биологической активности.Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для ЛГ(лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью второго ШР-ЧКГ и 1231-ЛГ в качестве меченого атома, которые содержат в ЛГ тройной К 1 Т (код 10204), поставляемый в настоящее время на рынок компанией Биодата. В качестве антисыворотки используют овечью анти-ХГГ (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100-ную перекрестную реакционную способность к ЛГ и менее, чем 0,1 к ФСГ.Методу радиоиммуноанализа в соответствии с наставлениями изготовителя придерживаются с тем, чтобы не было получено ншсакого загрязнения ЛГ, обнаруживаемого в высокоочищенном препарате мочевого ФСГ, полученном в соответствии с примером 1.Вышеприведенные результаты подтверждаются использованием более чувствительного анализа, называемого ВЕЬША (диссоциацияулучшенньтй лантанид-фторо-иммуноанализ),оборудование для проведения которою поставляется фирмой ЛКБ-Фармация.Блочный электрофорез в плоском геле додецилсульфате натрия осуществляют в восстановительных условиях на 1 З,5-ном полиакриламидном геле, рН 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Нейчур, 227, стр. 680-685 1970.Окрашивание осуществляют блестящим кумасси 51-250, 035 в 25 метаноле/ 75 уксусная кислота.Данному испытанию подвергают как препарат вом ФСГ в соответствии с настоящим изобретением, так и высокоочищенный препарат птпофизарного ФСГ (вог ФСГ), полученный,как описано выше.Анализы как вом ФСГ, так и вог ФСГ осушествляют на колонке ТЗК Ст 2000 5121 посредством ЛКБ с использованием 0,1 М буферного фосфатного раствора, рН 6,80,2 М МаС 1 в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/ мин, и считывание выполняют при длине волны 230 нм.Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Анфолин ЛКБ, рН 3,5-9,5), закрепленном в 11,5-ной (мас.) трихлоруксусной кислоте и 3,5-ной (мас.) сульфосалициловой кислоте, и окрашивают Серебряным окрашивающим набором БИ 0-РЭД.Данное испытание показывает, что мочевые и гипофизарные ФСГ не являются идентичными молекулами, а также то, что различия заключаются, по крайней мере, в их углеводородных частях, если не в самих белковых частях.Биологическую активность шт ФСГ высокоочищенного мочевого ФСГ определяют методом Стилмана-Толей (Эндокринология,53, стр. 604-616, 1953) с использованием в качестве эталонного вещества ЧКГ-Хаус Эталон, градуированный по 2-му Международному Эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми осионными фармакопеями и службами здравоохранения для определения международных единиц ПЛ.) биологической активности ФСГ.имеет удельную активность, равную 6200 1.1.1. ФСГ на мг лиофилизированното порошка, то есть, наиболее высокую удельную активность,когда-либо описанную для мочевого препарата ФСГ.а) Выделение субъединиц мочевого ФСГВыделение субъединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Шатегз, оборудованной колонкой Аквапор ЕРЗ 00, 20 Ок 4,6 мм, 7 мкм, (Браунил Лэбз). Элюентаъш являются А 0,1 ТА ( трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс.) ВО,055 ТБА в ацетонитриле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет собой 15 В. Градиент повышает на 40 В в течение 20 минут. УФ-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно вводят аналитические серии 20 мкл раствора 0,5 ваг/мл вом ФСГ и 0,5 ТРА. Предварительная инкубация в рас творе ТРА необязательна. Препаративно раз деление осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение ДОСТИГЕЮТ путем ввода 0,5 мг высокоочищенною человеческого мочевого ФСГ (серия М 032), растворенных в буфере А. Фракции собирают вручную и сушат с использованием концентрата Спид Вак. Субьединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД и хранят при температуре -20 С.Бета-субьединицу элюируют, приблизительно, через 10,5 мин в качестве широкого пика,альфа-субгьединицу элюируют в течение 15 МИН В КЗЧССТВС РСЗКОГО ПИКа. УЗНЗВЗНИС каждою пика в качестве бета- и альфа-субъедиНИЦЫ, СООТВВТСТВСННО, ОСУЩВСТВЛЯЮТ специфическим радиоиммуноанализом. Обычно, восстановление бета-субъединицы происходит вокруг значения 50, напротив,восстановление альфа-субъединицы составляет значение более, чем 90.Восстановление субъединиц, разделенных,как описано в части а), осуществляют в 0,5 Трио, 0,1 ЭДТК, бМ гуанидин-НС, рН 8,5,в течение 2 часов при температуре 37 С с использованием ДТТ (дитиотрейтола, Серна) при 15-кратном молярном избытке перед содержанием цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный перед ДТТ) и оставляют на 30 минут в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1-ный меркаптоэтанол и ТРА. Карбонсиметилированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субьм единица плохо растворяется в Воде так, что конечный выход совершенно незначителен.Восстановление бета-субъединицы, разделенной, как описано в части а), осуществляют при комнатной температуре в течение 2 часов следующим образом 0,1 мг бета-субъединицы,0,5 мл 0,5 М раствора Трис, 0,1 ЭДТК, бм гуанидин-НС 1, рН 8,5, 2,7 мг дитиотрейтола. Пиридилэтилирование осуществляют путем прибавления 0,02 мл 4-винилпиридина к предыдущему раствору. Реакция продолжается в течение 2 часов при комнатной температуре. Наконец реакционную смесь загружают в С 4-патрон (Бейкер), Уравновешенный 0,1 ГРА. Патрон промывают 0,1 ТРА и пиридилэтилированную бета-субъединицу элюируют 40 ацетонитрилом, 0,1 И, ТРА. Элюированные фракции сушат и очищают ЖХВД, как описано выше для бета-субъединицы. Пиридилэтиатированную бета-субъединицу, очищенную ранее путем ЖХВД,растворяют в 1-ном растворе ЫН 4 НСО 3, рН 8.В раствор прибавляют трипсин и реакцию осуществляют в течение 1,5 часа при температуре 37 С. Триптические фракции очищают жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с использованием ранее описанной методике, за исключением того, что градиент поднимают от 0 до 55 И, в течение 30 минут и УФ-детектор устанавливают на 214 нм.Триптические фракции секвенируют таким же образом, как осуществляют Секвенирование субъединиц (см. часть д).Несколько испытаний на определение последовательиости аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль или менее в белковой секвенсер (470 А, Эпплайд Биосистем) и используя стандартную программу ОЗРРТН, поставляемую Эпплайд Биосистем,или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют Рго или С 1 у, замещены специальным циклом ОЗСРКО. Первые 45 остатков, начиная с ЫНз-конца молекулы,идентифицируют, что приводит к результатам, подтверждаемым аминокислотной последовательностью, известной из литературы (1. Вйо. Спеки, 250, стр. 6735 (1975). Азп в положении 52 и в положении 78, относящиеся к известной последовательности, начинающейся с А 1 а представляют собой аминокислоты,где происходит тликозилирование. На конце МН всегда присутствует Неодно