Способ получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(71) Заявители Институт биохимии Академии наук Беларуси Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета им. В.И.Ленина Борисовский завод медицинских препаратов(73) Патентообладатели Институт биохимии Академии наук Беларуси Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета им. В.И.Ленина Борисовский завод медицинских препаратов(57) Способ получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью, путем связывания окситиамина с носителем, отличающийся тем, что в качестве носителя используют окисленный крахмал, связанный с окисленным крахмалом окситиамин обрабатывают раствором метотрексата с последующим высаждением целевого продукта органическим растворителем.(56) 1. А.с.1601821, МКИ А 61 К 31/57, 1989. Изобретение относится к биохимии, в частности к витаминологии и экспериментальной онкологии, и может быть использовано в экспериментальной практике. Наиболее близким по совокупности признаков и получению требуемого технического результата (прототипом) к заявленному изобретению является способ получения препарата, обладающего антивитаминной активностью,путем сорбции окситиамина полиангидроглюкуроновой кислотой,причем полиангидроглюкуроновую кислоту предварительно растворяют в водном растворе щелочи при рН 13,2-14 и отношении веса полиангидроглюкуроновой кислоты к объему раствора 18-10 с последующей нейтрализацией раствора до рН 5,5-6,5, а сорбцию проводят при весовом отношении окситиамина и полиангидроглюкуроновой кислоты 1(0,75-2,0) 1. Препарат, полученный по известному способу, обладает также и противоопухолевым действием (см. Зиматкина Т.И., Зиматкин С.М., Титова С.П. и др. Доклады АН Беларуси, 1992 г., Т.36,6, С.552-557). Недостатком известного способа является то, что полученный препарат используют в виде мелкодисперсной суспензии в растительном масле, что ограничивает пути введения препарата экспериментальным животным. Кроме того, полученный препарат при однократном введении его в организм (подкожно в виде суспензии в персиковом масле) животного обладает недостаточно сильным канцеростатическим действием. Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в получении препарата, обладающего более высоким противоопухолевым и антивитаминным действием и в расширении путей введения препарата в организм животного. Указанная задача решается тем, что в известном способе получения препарата, обладающего противоопухолевой и антивитаминной активностью, путем связывания окситиамина с носителем, согласно изобретению, в качестве носителя используют а-соль окисленного крахмала с содержанием карбоксильных групп 10-25 мас., а связанный с а-солью, окисленного крахмала окситиамин обрабатывают раствором метотрексата с последующим высаждением целевого продукта органическим растворителем. 2049 1 Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением положительного эффекта при использовании всей совокупности признаков изобретения, указанной в его формуле. Пример 1. К 6,1 г окисленного крахмала с содержанием карбоксильных групп 20,4 мас. добавляют 24,3 мл водного раствора, содержащего 1,1 г гидроксида натрия и 1,3 г окситиамина, перемешивают до полного растворения окисленного крахмала и доводят рН до 7-7,2. К полученному раствору приливают 5 мл физиологического раствора (0,9 ), содержащего 5 мг метотрексата, перемешивают в течение 2-х часов и лиофильно высушивают. Содержание окситиамина и метотрексата в полученном препарате в пересчете на 1 г окисленного крахмала составляет 210 мг/г и 0,82 мг/г. Соотношение окисленного крахмала, окситиамина, метотрексата в образце составляет 10,210,00082. Исследования противоопухолевой активности заявляемого препарата проводили на беспородных белых мышахсамках массой 18-21 г с быстрорастущими, высокозлокачественными опухолями. Асцитный рак Эрлиха (АРЭ) перевивали животным внутрибрюшинно, а саркому 180 (С-180) подкожно от мышей-доноров по общепринятой методике (см. Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии. под ред. Першина Г.Н. М., 1971. С.357-382). Через сутки после перевивки опухоли контрольным животным вводили однократно подкожно окисленный крахмал, а мышам опытных групп заявляемый препарат (лабораторный шифр АТ-10-14) с дозами окситиамина (ОТ) и метотрексата 2000,75 мг/кг. Мышей с АРЭ декапитировали на 5,9 и 12- сутки после перевивки опухоли, что соответствовало начальному, интенсивному и терминальному периодам роста неоплазмы у контрольных животных(см. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М. 1977, С. 45-134). Асцитную жидкость у животных с АРЭ собирали в пробирки с гепарином, опухолевые клетки отделяли низкоскоростным центрифугированнем (1500 об/мин, мин). Измеряли объем асцита и осадка опухолевых клеток. На основании полученных данных и значении средней массы тела животных в группах к концу определяемого срока рассчитывали индексы торможения роста неоплазмы (т), коэффициенты противоопухолевой активности (Ка) и индексы эффективности препаратов (э) (см. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М. 1977. С. 45-134 Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии. под ред. Першина Г.Н. М., 1971, С.357-382). В отдельном эксперименте исследовали время жизни животных, рассчитывали среднюю продолжительность (Т) и показатели времени жизниопытных мышей по сравнению с контрольными. (см. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М. 1977, с.35). Сравнительную количественную оценку эффективности противоопухолевого действия соединений проводили комплексно на основании всех перечисленных выше показателей, а также на основании сроков жизни опухоленосителей. Результаты расчетов сведены в таблицы 1 и 2. В таблицах 1 и 2 приведены данные исследований противоопухолевого действия препарата, полученного по заявляемому способу (лабораторный шифр АТ-10-14), в сравнении с контролем (водный раствор -соли окисленного крахмала), прототипом (лабораторный шифр АТ-10-4-окситиамин, связанный с полиангидроглюкуроновой кислотой) и окситиамином (лабораторный шифр -10-2). Среднее время жизни мышей контрольной группы с АРЭ составило 16,60,3 сут. При применении АТ-10-14 срок жизни опухоленосителей возрастал в 2,8 раза и был выше, чем в случае использования -10-2 или АТ-10-4 (табл.1). Сопоставление силы и длительности антибластомного действия препаратов по величинам Т и Ка, (табл.2) говорит о том, что полученный препарат обладает выраженными пролонгированными противоопухолевыми свойствами и вызывает значительное торможение роста АРЭ. Анализ противоопухолевого действия препаратов по величине э, как критерию, учитывающему также увеличение времени жизни опухоленосителей, указывает на большую эффективность АТ-10-14 и по этому критерию. Антиметаболитное действие препаратов исследовали в опытах на белых мышах - самках массой 18-20 г. Мыши контрольной группы получали водный раствор окисленного крахмала (ОК) . В качестве препарата сравнения использовали окситиамин в виде нейтрализованного водного раствора (лабораторный шифр -102), а также окситиамин, связанный с полиангидроглюкуроновой кислотой, -прототип (лабораторный шифр АТ 10-4). Мышей содержали на стандартном рационе вивария. Декапитацию животных проводили на 1, 3, 5, 8, 2 сутки опытов. Об антитиаминовой активности веществ судили по степени ингибирования ими в крови и тканях транскетолазы (ТК), наиболее чувствительного к действию -10-2 тиаминзависимого фермента. (см.А,Е. // . , 1961. . 263, 3, .617-628 Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты. М., 1978), активность которого определяли по методу Брунса (см.,.,Е. // . ., 1958,.330. 3, .497-507) в модификации Островского Ю.М. (см. Экспериментальная витаминология, под. ред. Ю.М. Островского, Мн., 1979). В качестве количественных характеристик антикоферментного действия соединений в целях стандартизации данных использовали величины приведенной активности ТК (А), соответствующие активности фермента в опытной группе при активности ТК в контрольной, равной 100 нмоль седогептулозо-7-фосфата/мл крови, мг ткани или гемоглобина/мин., ингибирующего эффекта (ИЭ, мкмоль седогептулозо-7-фосфата мл крови/мг ткани или гемоглобина), найденные интегрированием зависимости (100-А)в пределах 5-12 2 2049 1 сут, и констант скорости восстановления активности ТК (, сут.-1), рассчитанных по кинетическому уравнению для необратимых реакций псевдопервого порядка. В табл 3. представлена динамика изменения активности ТК в различных органах животных с первых по двенадцатые сутки опытов после введения препарата. Полученные данные говорят о более сильном и длительном в сравнении с Т-10-2 ингибировании фермента в организме животных при применении АТ-10-14. Максимальное снижение активности ТК наблюдалось на 5-е сутки после введения соединений. В последующие сроки отмечено постепенное восстановление активности ферментов. При применении АТ-10-14 этот процесс был более замедленным, чем в случае использования -10-2. В табл. 4 приведены величины ИЭ и , позволяющие количественно сравнить силу и длительность антитиаминового действия соединений и сопоставить их эффективность. Анализ полученных данных говорит о том, что АТ-10-14 характеризуется гораздо меньшими, в сравнении с -10-2, скоростями восстановления активности ТК в организме животных и более высокими значениями ингибирующих эффектов, т.е. проявляет в организме подобно АТ-10-4 пролонгированные антивитаминные свойства. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что новый комбинированный препарат, полученный заявленным способом, проявляет пролонгированное антивитаминное действие в организме животных и превосходит окситиамин, а также прототип по своей противоопухолевой активности, вызывая более длительное и сильное торможение роста злокачественных новообразований. Таблица 1 Средняя продолжительность (Т) и показатели времени жизни мышей-опухоленосителей с асцитным раком Эрлиха (АТЭ). Таблица 2 Параметры противоопухолевого действия соединений Препараты 2049 1 Таблица 3 Величины приведенной активности (А) транскетолазы(нмоль седогептулозо-7-фосфата/мл крови или мг ткани/мин) Препараты Кровь Контроль- достоверные (0,05) по отношению к контролю значения Таблица 4 Количественные характеристики антитиаминового действия препаратов окситиамина Ткань Кровь Печень Селезенка оставитель А.И. Сорокин Редактор Т.А. Лущаковская Корректор Т.Н. Никитина Заказ 0030 Тираж 20 экз. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.