Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ – 40А – штамм-антиген.

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Ломако Юрий Васильевич Яромчик Ярослав Петрович Опарина Ирина Владимировна Гусев Анатолий Алексеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2222592 2, 2004. ГОЛОВКО А.Н. и др. Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины. - Т. 34. 1998. - С. 118-120. ЯРОМЧИК Я.П. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. - Т. 45. - Вып. 1. - Ч. 1. - 2009. - С. 180-184. АНДРОСИК Н.Н. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. - Т. 40. - Ч. 1. - 2004. - С. 167-168. ОПАРИНА И.В. и др. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология, санитария. - 2009. -3. - С. 7-14.2222591 2, 2004.2244743 2, 2005.(57) Штамм бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген. Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин, гипериммунных сывороток для специфической профилактики колибактериоза. Колибактериоз сельскохозяйственных животных является широко распространенной болезнью новорожденного молодняка и причиняет значительный экономический ущерб животноводству многих стран мира с развитым животноводством. Важным мероприятием при профилактике и ликвидации колибактериоза принадлежит специфической профилактике за счет вакцинации матерей-рожениц в последние месяцы беременности с целью создания колострального иммунитета у новорожденных животных при выпойке им иммунного молозива в первые часы жизни. В настоящее время известен депонированный штамм, который используется для производства вакцин против колибактериоза - штаммВГНКИ 334-37/12 с антигенным составом 0140 К 87 К 88 1. 18287 1 2014.06.30 Недостатком этого штамма является его сравнительно низкая антигенная активность. Титр антител в сыворотке крови кроликов составлял 11600, в результате агглютинации с гомологичной О-коли сывороткой показатели титра составили до 13200 и с гетерологичными сыворотками 08, 09, 0142, 047 1100 и 0103-1300 а с анти-К 88 сывороткой до титра 1800, что не позволяет применять их в низких концентрациях бактериальных клеток при иммунизации животных (суспензия штамма в культуральной среде микробных клеток составляет 4,51012-5,01012). За прототип возбудителя болезни колибактериоза телят взят штамм бактерий 27 0138 К 88 МГАВМ и Б-ДЕП, который применяется с целью производства вакцин, предназначенных для специфической профилактики колибактериоза. Известный штамм бактерий 27 0138 К 88 - возбудитель колибактериоза - отнесен к семейству , к роду, выделен НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из тонкого отдела кишечника теленка,совхоз Гремячинский, Тульской обл., в 1988 г. Штамм депонирован 27 апреля 2001 г.,регистрационный номер - штамм 27 0138 К 88 - МГАВМиБ-ДЕП во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Производственный штамм бактерий 27 0138 К 88 обладает следующими характеристиками. Антигенная структураантиген К 88 белковой природы, нуклеотидный состав ДНК(ГЦ) - 51,4, содержит плазмиды с 60 и 5 МДа. Культурально-морфологические свойства. Грамотрицательные подвижные полиморфные палочки образуют полупрозрачные -колонии через 1324 ч роста на плотной питательной среде при температуре 3638 С. Ферментативная активность. Ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннит, сорбит, не ферментирует инозит, образует индол, не образует сероводород, уреазу, ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Серологические свойства. Агглютинируется с сыворотками 0-коли 0138 и антиадгезивной К 88 в реакции агглютинации на стекле. Токсигенность. Штамм продуцирует термолабильный энтеротоксин. Антигенная активность. При введении антигена животным вырабатывается антитоксический и гуморальный иммунитет. После иммунизации мышей уровень специфических антител при постановке реакции агглютинации (РА) в сыворотках крови животных достигает значения 4,00,24 2. Патогенные свойства. Вирулентен для новорожденных телят при пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.т. На 2-3 сутки вызывает проявление клинических признаков и на 5 сутки - гибель животных. Вирулентность. ЛД 50 для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 4,6107 живых м.т. Условия хранения и транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при температуре (-18)(-20) С. Срок хранения 10 лет 2. Недостатком известного штамма является его сравнительно низкая антигенная активность - уровень специфических антител в сыворотках крови иммунизированных мышей достигает значения 4,00,24 2, известный штамм выращивают в реакторах при температуре -3638 С в казеиновом бульоне, при интенсивном механическом перемешивании и аэрации стерильным воздухом в течение 10-16 ч. При этом концентрация микробных клеток составляет 50-60 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А.Тарасевича, что не позволяет получить высокий выход бактериальной массы и,соответственно, увеличивает себестоимость при производстве биологической продукции. На известных штаммах невозможно получить заявляемый антиген, так как известные штаммы имеют отличия в антигеном отношении, а также обладают более низкими показа 2 18287 1 2014.06.30 телями антигенной и иммуногенной активности, что отрицательно влияет на иммунологические и протективные показатели производимых биопрепаратов против колибактериоза. В связи с этим актуальной остается проблема поиска штаммов бактерийдля производства иммуногенных специфических средств для профилактики и лечения колибактериоза сельскохозяйственных животных. Задачей настоящего изобретения стало получение нового производственного штамма бактерий, соответствующего по своей антигенной структуре штаммам бактерий, циркулирующим на территории Республики Беларусь, обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью, что позволит изготавливать из его высокоэффективные биологические препараты для проведения специфической профилактики колибактериоза сельскохозяйственных животных. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген - путем выделения его из селезенки павшего теленка шестидневного возраста, принадлежащего СПК Ставокский Пинского района Брестской области, Республика Беларусь. Характеристика штамма бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген. Таксономическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджи,относится к пятой группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1, семейство , роду , виду. Тинкториальные признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Грамму имеет вид тонких коротких (0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательных палочек. Культурально-морфологические признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые блестящие выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерия образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром, подвижен. Физиолого-биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, манит,сорбит, арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа,продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенный состав. Имеет в своем составе адгезивный антиген К 88, О-антиген, не типируемый коммерческим набором О-колисывороток, содержит жгутиковый антиген. Чувствительность к антибиотикам. ШтаммКМИЭВ-40 А - штаммантиген - чувствителен к канамицину, левомицетину, гентамицину, умеренно устойчив к эритромицину (галлимицину), карбенициллину, спектиномицину (спектаму), стрептомицину, мономицину, устойчив к ампициллину (амписуру), доксициклину, пенициллину,олеандомицину, метицилину, линкомицину, кобактану, амоксициллину (ветримоксину),тетрациклину, окситетрациклину, ристомицину. Вирулентность, иммуногенность. ШтаммКМИЭВ-40 А - штаммантиген - патогенен. При внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-40 А составляет 100 ,антигенность - 13,60,24 2. Условия о криоконсервации. ШтаммКМИЭВ-40 А - штамм-антиген хранится при температуре 24 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные 18287 1 2014.06.30 среды (МПБ и МПА на основе перевара Хоттингера) 1-2 раза в месяц при условии хранения при 24 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет высокую антигенную активность, по сравнению с прототипом. Так, при проведении РА с сывороткой крови иммунизированных кроликов уровень специфических антител в сыворотках крови достигает значения 13,60,24 2, тогда как в прототипе титр антител составил 4,00,24 2, что позволяет нам достичь поставленной задачи. Пример 1. Выделение штамма бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген. Патологический материал засевают в пробирки с МПБ на плотную подсушенную дифференциально-диагностическую среду Эндо и МПА в чашках Петри. Участок селезенки размером 2,52,5 прижигают, и стерильным концом пастеровской пипетки скарифицируют, и растирают шпателем по поверхности среды Эндо, а также на МПА, и вносят в МПБ, и инкубируют при температуре 37 С. На элективной среде Эндо через 24 ч устанавливают образование круглых средних,иногда мелких размеров колонии (диаметром 2-4 мм), выпуклые или слегка приподнятые в центре, с гладкой поверхностью, ровными краями, красного или малинового цвета на агаре Эндо с наличием металлического блеска. Пример 2. Культивирование штамма бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген. Штамм бактерийКМИЭВ-40 А - штамм-антиген - выращивают в течение 8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 С скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливаютсреды. Понижениев растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 -ного растворадо 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором глюкозы из расчета 0,3 сухого вещества глюкозы на 1 л среды. Пример 3. Серологическая идентификация штаммаКМИЭВ-40 А - штаммантиген. Для серологической идентификации штаммаКМИЭВ-40 А - штаммантиген - применяют РА на стекле с агглютинирующими О-коли и антиадгезивными коли-сыворотками, вначале с комплексной, а при наличии положительной реакции с моновалентными сыворотками. Антиген для серологических реакций готовят по следующей методике испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА или среде Минка при температуре 37 С в течение 18-20 ч, смывают 2-5 мл физиологического раствора. Постановка реакции каплю диагностической сыворотки наносят на стекло, стерильной пипеткой добавляют каплю испытуемой культурыКМИЭВ-40 А - штаммантиген, выращенной на скошенном МПА или среды Минка. Культуры, выросшие в чашках Петри, берут бактериологической петлей и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при температуре 18-28 С. При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной. Контроли антигена а) стабильность - антигенизотонический раствор натрия хлорида. Реакция отрицательная б) специфичность - антигеннормальная (отрицательная) кроличья сыворотка. Реакция отрицательная. 18287 1 2014.06.30 Культура на МПА или среде Минка, давшая положительную реакцию агглютинации с моновалентной антиадгезивной сывороткой и имеющая типичные дляморфологические, тинкториальные и культуральные свойства, считается возбудителем колибактериоза с адгезивным антигеном К 88, что является видовым признаком. Пример 4. Определение иммуногенных свойств штаммаКМИЭВ-40 А - штаммантиген. ШтаммКМИЭВ-40 А - штамм-антиген - культивируют на агаровой питательной среде, далее смывают стерильным физраствором, доводя до концентрации 5 млрд. микробных клеток в 1 мл. Инактивируют штаммКМИЭВ-40 А штамм-антиген - формалином в конечной концентрации 0,4 к объему. Далее двукратно с интервалом 7 дней иммунизируют белых мышей. Для этого 10 белым мышам штаммантиген вводят подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяют через 1014 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью бульонной культуры штаммаКМИЭВ-40 А - штамм-антиген - в тест-дозе 0,5 мл. Штамм-антиген считают иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 70 животных при гибели контрольных 90 и более животных в течение 10 суток после заражения. Пример 5. Определение антигенной активности штаммаКМИЭВ-40 А - штаммантиген. Инактивированным штаммомКМИЭВ-40 А - штаммом-антигеном иммунизируют 3-4 кроликов двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 млрд. м.т./мл в объеме 2,0 см 3, с последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых планшетах. Таким образом, заявляемый штамм имеет более высокую антигенную активность по сравнению с прототипом. Так, при проведении РА с сывороткой крови иммунизированных кроликов уровень специфических антител в сыворотках крови достигает значения 13,60,24 2, тогда как в прототипе титр антител составил 4,00,24 2, что позволяет его использовать для констуирования вакцин для профилактики эширихиоза сельскохозяйственных животных. Источники информации 1. Патент 1149467, МПК 661 39/108, 1995. 2. Патент 2222592, МПК 761 39/108,12 1/20, 2004 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5