Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae КМИЭВ – В106 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Ломако Юрий Васильевич Борисовец Дмитрий Сергеевич Опарина Ирина Владимировна Гусев Анатолий Алексеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) Штамм бактерийКМИЭВ-В 106 - штамм-антиген. Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моновакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных, а также ассоциированных вакцин для профилактики желудочнокишечных инфекций животных. В настоящее время широко распространены заболевания телят, в этиологии которых участвуют ранее редко встречаемые бактерии. Одним из таких представителей условнопатогенной группы бактерий являются клебсиеллы, патогенная роль которых для животных и птицы явно недооценивается. Природная устойчивость к антибиотикам и дезинфектантам, низким и высоким температурам, ультрафиолетовому облучению, способность противостоять защитным механизмам макроорганизма выводят их на передний план в этиологии заболеваний как молодняка, так и взрослого поголовья 1. За прототип взят штамм бактерий 23, депонированный в ВГНКИ под 23 МГАВМиБ-ДЕП. Производственный штамм бактерий 23 обладает следующими характеристиками. Назначение. Штамм бактерий 23 применяется с целью производства вакцин против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных, а также для получения иммунных препаратов для профилактики и лечения острых кишечных заболеваний животных. Происхождение. Штамм бактерий 23 выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из фекалий новорожденного теленка. 18288 1 2014.06.30 Таксономическая принадлежность. Штамм бактерий 23 отнесен к семейству , роду , виду. Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, не образует спор, при окраске по Бурри установлено наличие капсул, не имеет жгутиков,неподвижен. На МПБ через 5-6 ч роста наблюдается равномерное помутнение среды с образованием поверхностной пленки, на среде Эндо образует красные колонии, на среде Плоскирева - розовые колонии с желтоватым центром, на МПА - полупрозрачные колонии слизистой консистенции, на 5 -ном кровяном агаре образует зоны лизиса. Ферментативные свойства. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также сахарозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, сорбит, маннит, инозит, не образует индол, сероводород, образует ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Антигенная структура. Серотипирован набором клебсиеллезных К-сывороток НИИВС им. Мечникова какК 8. Патогенные свойства. Вирулентен для белых мышей. 50 при внутрибрюшинном введении составляет 3,1108 живых микроклеток. Иммуногенные свойства. При иммунизации 11550 голов стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей вакциной из производственного штамма бактерий 23 сохранность поголовья составляет 96-99 . Сведения о криоконсервации. Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18-20 С после пассажа через организм белых мышей 2. Недостатком известного штамма является низкая противоэпизоотическая эффективность вакцины, сконструированной на его основе это обусловлено тем, что известный штамм обладает антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками эпизоотических штаммов бактерий,циркулирующих на территории Республики Беларусь. Кроме того, данный штамм имеет сравнительно низкую вирулентность. Известный штамм является слабовирулентным и обладает антигенными и иммунобиологическими отличиями в сравнении с циркулирующими в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь эпизоотическими штаммами возбудителей, поэтому вакцинные препараты, изготовленные на основе известного штамма-прототипа, будут характеризоваться более низкой профилактической эффективностью. В связи с этим является актуальной проблема выделения штамма бактерий, пригодного в условиях Республики Беларусь для конструирования профилактических биопрепаратов против клебсиеллезной инфекции и ассоциированных желудочно-кишечных инфекций животных, имеющего высокую вирулентность и соответствующего по своим антигенным и иммунобиологическим свойствам эпизоотическим штаммам. Задачей настоящего изобретения стало получение штамма бактерийс высокой вирулентностью и иммуногенностью, имеющего схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, позволяющим конструировать биопрепараты против клебсиеллезной инфекции с высокими профилактическими показателями. Поставленная задача достигается тем, что нами выделен штамм бактерий- штамм-антиген - из печени павшего теленка 3-дневного возраста, принадлежащего СПК Острошицы Логойского района Минской области, Республика Беларусь. Штамм получен путем посева печеночной ткани на агар Эндо с последующим выделением чистых культур, сбора коллекции штаммов, отбора из них наиболее активного в антигенном и иммуногенном отношениях, отличающегося высокой вирулентностью. Штамм бактерий- штамм-антиген - депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ-В 106. 2 18288 1 2014.06.30 Характеристика штаммаКМИЭВ-В 106 - штамма-антигена. Таксономическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджи,относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек,подгруппе 1 - семейство , роду , виду. Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные, неподвижные палочки размером 0,71,5 мкм, спор не образуют, образуют капсулу. Физиолого-биохимические признаки. На МПБ и бульоне Хоттингера дает гомогенное помутнение с образованием осадка и поверхностной пленки, на МПА образует пышные,часто сливающиеся слизистые колонии консистенции, на среде Эндо - сливающиеся влажные малиновые колонии с металлическим блеском. Ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, не сбраживает мальтозу, гидролизуют мочевину, не дезаминирует фенилаланин, не разжижает желатин, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенный состав. Включает соматический О-антиген и капсульный К-антиген. Чувствительность к антибиотикам. ШтаммКМИЭВ-В 106 штамм-антиген - чувствителен к стрептомицину, гентамицину, левомицетину, неомицину,канамицину, умеренно устойчив к пенициллину, устойчив к ампициллину, тетрациклину,эритромицину. Вирулентность, иммуногенность. ШтаммКМИЭВ-В 106 штамм-антиген - патогенен. При внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. 50 для белых мышей составляет 1,2109 м.к./0,5 мл 18-часовой бульонной культуры. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-В 106 штамма-антигена - составляет 100 , антигенность - 9,5 2. Условия хранения. Хранят при 24 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды (МПБ и МПА на основе перевара Хоттингера) 1-2 раза в месяц при условии хранения при 24 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет высокую вирулентность по сравнению с прототипом. Так, 50 заявляемого штамма для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 1,2108 живых микробных клеток, тогда как в прототипе данный показатель составил 3,1108, следовательно, для гибели 50 мышей в группе требуется меньшее количество микробных клеток (1,2108) при использовании заявляемого штамма по сравнению с прототипом(3,1108). Кроме того, заявляемый штамм выделен на территории Республики Беларусь и имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами,что позволяет нам достичь поставленной задачи. Пример 1. Выделение штамма бактерийКМИЭВ-В 106 - штамма-антигена. Патологический материал засевают в пробирки с МПБ, на плотную дифференциальнодиагностическую среду Эндо и МПА в чашках Петри. Для этого раскаленным шпателем прижигают участок печени размером 2,02,0, с помощью пастеровской пипетки с данного участка проводят отбор материала, который вносят в пробирки с МПБ и на поверхность среды Эндо, а также на МПА и растирают шпателем, инкубируют при температуре 37 С. Аналогичные операции проводят при отборе проб с других паренхиматозных органов. Через 24 ч на агаре Эндо устанавливают образование крупных, влажных, сливающихся малиновых колоний с металлическим блеском, что является характерным дифференциальным признаком. Пример 2. Культивирование штамма бактерийКМИЭВ-В 106 - штаммаантигена. 3 18288 1 2014.06.30 В бактериологические матрасы разливают по 250 см 3 стерильного мясопептонного агара на основе перевара Хоттингера, который стерилизуют 30 мин при давлении 1 атм. На застывший агар заливают по 5,0 см 3 суточной бульонной культуры. Культивируют при 37 С, оптимальный уровень- 7,20,2. Через 24 ч выросшую культуру смывают 0,85 -ным стерильным раствором натрия хлорида из расчета 50 см 3 на 1 матрас. Концентрацию биомассы доводят по стандарту мутности до 10 млрд микробных клеток в 1 см 3. Пример 3. Определение иммуногенных свойств штамма бактерийКМИЭВВ 106 - штамма-антигена. Штамм бактерийКМИЭВ-В 106 - штамм-антиген - культивируют на МПА 24 ч при температуре 37 С, далее смывают стерильным физраствором, доводя концентрацию биомассы до 5 млрд микробных клеток в 1 см 3. Проводят инактивацию формалином в 0,4 -ной концентрации, в качестве адъюванта используют алюмокалиевые квасцы в количестве 10 к объему, белым мышам. Далее двукратно, с интервалом 7 дней,иммунизируют белых мышей. Штамм бактерийКМИЭВ-В 106 - штаммантиген - вводят белым мышам в количестве 10 голов подкожно в дозе 0,2-0,3 см 3. Напряженность иммунитета проверяют через 10-14 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10-ти вакцинированных и 10-ти контрольных животных 18-часовой смесью бульонной культуры штамма бактерийКМИЭВВ 106 - штамма-антигена - в тест-дозе 0,5 см 3. Штамм-антиген считают иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 70 животных, при гибели контрольных 90 и более животных в течение 10 суток после заражения. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-В 106 - штамма-антигена - составляет 100 . Пример 4. Определение антигенной активности штамма бактерийКМИЭВВ 106 - штамма-антигена. Препаратом из штамма бактерийКМИЭВ-В 106 штаммаантигена, полученным по примеру 3, иммунизируют 3-4 кроликов двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 млрд микробных тел/мл в объеме 2,0 см 3, с последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых планшетах. Титр антител в сыворотке крови кроликов в РА составляет не ниже 1512. Таким образом, штамм бактерийКМИЭВ-В 106 - штаммантиген - выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм обладает более высокой вирулентностью в сравнении с прототипом - 1,2108 (3,1108 у прототипа), характеризуется высокой иммуногенностью, активен в антигеном отношении и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Источники информации 1. Терехов В.И., Гугушвили Н.Н. Частота встречаемости и характеристика штаммов клебсиелл, выделенных при заболеваниях у телят // Ветеринарная отрасль проблемы и перспективы. Науч. тр. Кубан. гос. аграр. ун-т / Под ред. В.А. Мищенко. - Кубань, 1995. Вып. 349. - С. 91-93. 2.2221864, МПК 7,1 1/20,61 39/108, 2004 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4