Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ломако Юрий Васильевич Опарина Ирина Владимировна Новикова Оксана Николаевна Красочко Петр Альбинович Яромчик Ярослав Петрович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2043771 1, 1995.10978 1, 2008.10884 1, 2008.67040 , 2004.65820 , 2004.2222592 2, 2004. ЛОМАКО Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на основе адгезивных антигенов возбудителя. Автореф. дис. - Минск, 2003. - С. 3, 15. ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства. Материалымеждународной научно-практической конференции. Витебск, 2005. - С. 69-70. МАКСИМОВИЧ В.В. и др. Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции. Тезисы докладов международной научнопрактической конференции. - Жодино,2007. - С. 353-355. Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин, гипериммунных сывороток против колибактериоза. Колибактериоз сельскохозяйственных животных по количеству неблагополучных пунктов, количеству заболевших и павших животных занимает первое место среди болезней бактериальной этиологии. Наряду с соблюдением зоотехнических и ветеринарно-санитарных правил кормления и содержания новорожденных животных значительным мероприятием профилактики колибактериоза остается специфическая профилактика. Поэтому изыскание новых средств борьбы с данной болезнью, в том числе и поиск новых, обладающих высокой иммуногенностью и антигенностью штаммов, является актуальным аспектом при разработке биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики. 17486 1 2013.08.30 В настоящее время известен депонированный адгезивный штамм 41,который используют при конструировании вакцины против колибактериоза свиней 1. Недостатком этого штамма является его достаточно невысокая антигенная активность. Титр антител в сыворотке крови иммунизированных свиноматок составлял 1850,62 за 14-21 день до опороса, по сравнению с контролем 1200,71, что не позволяет получить высокие профилактические показатели при применении вакцины, в составе которой присутствует данный штамм, так, профилактическая эффективность этой вакцины составляет 94,4 , из 54 голов 3 поросят заболели, а в контроле из 53 голов заболели 6 поросят. За прототип возбудителя болезни колибактериоза телят взят штаммВГНКИ 398-37/14. Производственный штамм бактерийВГНКИ 398-37/14 обладает следующими характеристиками. Назначение. ШтаммВГНКИ 398-37/14 применяется с целью производства вакцин и гипериммунных сывороток против колибактериоза. Происхождение. ШтаммВГНКИ 398-37/14 выделен от теленка 3 дневного возраста. Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерийВГНКИ 398-37/14 - возбудитель колибактериоза, отнесен к семейству, к роду. Культурально-морфологические свойства. Грамотрицательные, подвижные, полиморфные палочки, образуют полупрозрачные -колонии через 13-24 ч роста на плотной питательной среде при температуре 36-38 С. Ферментативная активность. Ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннит, сорбит, не ферментирует инозит, образует индол, не образует сероводород, уреазу, ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Серологические свойства. Штамм бактерийВГНКИ 398-37/14 в своем составе имеет типируемый соматический антиген О 101 и обладает наличием адгезивного антигена 41 агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 13200 и гетерологичными сыворотками О 4-1400, О 9, О 15, О 138-1200, О 2, О 18-1100, О 117,О 142-150 сывороткой 41 до титра 1800 активно продуцирует адгезивный антиген 41 на среде Хоттингера при культивировании в реакторе при температуре 37-38 С, аэрации и активном перемешивании. Антигенная активность. Титр адгезивного антигена 41 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-41 сывороткой (титр 164) составляет 18-116. Антигенную активность определяют в РА. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 11280. Иммунизация вакциной против колибактериоза животных, в состав которой входил известный штамм, привела к следующим показателям сохранность поросят составила соответственно 95,5 против 87,9 в группе контроля, которым применяли производственный аналог, телят - 98 против 92,2 в группе контроля, заболеваемость поросят 16,2 против 38,4 , телят - 11,2 против 33,3 . Сведения о криоконсервации. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при температуре (-18)-(-20) С. Срок хранения 10 лет 2. Недостатком известного штамма является его сравнительно низкая антигенная активность - титр адгезивного антигена 41 в РДП с моноспецифической антиадгезивной 41 сывороткой (титр 164) составляет 18-116. Титр антител в сыворотке крови кроликов после иммунизации составляет 11280. Данные недостатки привели к достаточно низким показателям профилактической эффективности по показателям сохранности и заболеваемости телят и поросят 2. На известных штаммах невозможно получить заявляемый штамм-антиген, так как известные штаммы обладают более низкими показателями антигенной и иммуногенной ак 2 17486 1 2013.08.30 тивности, что отрицательно влияет на профилактические показатели изготавливаемых из них биопрепаратов против колибактериоза, а также в связи с имеющимися отличиями в антигеном отношении, которые могут сказаться на эффективности производимых биопрепаратов против колибактериоза, связанных с несовпадением антигенной структуры вакцинных и эпизоотических штаммов. В связи с этим актуальной остается проблема изыскания штаммов бактерийдля конструирования специфических средств против колибактериоза с высокими иммуногенными характеристиками. Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокими антигенными и иммуногенными свойствами, позволяющего конструировать биопрепараты против колибактериоза с высокими профилактическими показателями. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген путем выделения его из головного мозга павшего теленка 2-дневного возраста, принадлежащего СПК Ставокский Пинского района Брестской области, Республика Беларусь. Характеристика штамма бактерийКМИЭВ-98 - штамма-антигена. Таксономическая принадлежность.относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство ,роду , виду. Морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Грамму имеет вид тонких коротких (0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательных палочек. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерии образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром. Биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит,арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты,дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные признаки. Имеет в своем составе адгезивный антиген 41, О-антиген, не типирусмый коммерческим набором О-колисывороток, содержит жгутиковый антиген. Патогенность, иммуногенность. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антитен патогенен для белых мышей. 50 составляет 670 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-98 составляет 100 , антигенность в РА с 13,80,14 2. Условия хранения. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген хранится при температуре 2 4 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет высокую антигенную активность по сравнению с прототипом. Так, данный показатель при проведении РА с сывороткой крови кроликов составил 14098-18192, тогда как в прототипе данный показатель составил 11280, титр адгезивного антигена 41 в реакции диффузной преципитации с моноспецифической анти-41 сывороткой составил 132-164, тогда как в известном штамме - 18-116, что позволяет нам достичь поставленной задачи. 3 17486 1 2013.08.30 Пример 1. Выделение штамма бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген. Патологический материал, полученный от павших или вынужденно убитых больных колибактериозом телят, засевают в пробирки с МПБ, на плотную дифференциальнодиагностическую среду Эндо и МПА в чашках Петри. Патологический материал - участок головного мозга размером 2,52,5 прижигают, и стерильным концом пастеровской пипетки скарифицируют и растирают шпателем по поверхности среды Эндо, а также на МПА и вносят в МПБ и инкубируют при температуре 37 С в течение суток. Параллельно проводят аналогичные операции при отборе проб с других паренхиматозных органов. При отборе проб со слизистой тонкого кишечника ее предварительно очищают от содержимого. На элективной среде Эндо через 24 ч наблюдают образование круглых, средних, иногда мелких размеров колонии (диаметром 2-4 мм), выпуклые или слегка приподнятые в центре,с гладкой поверхностью, ровными краями, красного или малинового цвета с наличием металлического блеска. Культивирование штамма бактерийКМИЭВ-98 штамм-антиген. Пример 2. Культивирование штамма бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген. Штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген выращивают в течение 8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 С скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливаютсреды. Понижениев растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 -ного растворадо 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором глюкозы из расчета 0,3 сухого вещества глюкозы на 1 л среды. Пример 3. Серологическая идентификация штаммаКМИЭВ-98 - штамм-антиген. Для серологической идентификации штаммаКМИЭВ-98 - штаммантиген применяют РА на стекле с агглютинирующими О-коли и антиадгезизными колисыворотками, вначале с комплексной, а при наличии положительной реакции - с моновалентными сыворотками. Антиген для серологических реакций готовят по следующей методике испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА или среде Минка при температуре 37 С в течение 18-20 ч, смывают 2-5 мл физиологического раствора. Постановка реакции каплю диагностической сыворотки наносят на стекло, стерильной пипеткой добавляют каплю испытуемой культурыКМИЭВ-98 - штамм-антиген,выращенной на скошенном МПА или среде Минка. Культуры, выросшие в чашках Петри,берут бактериологической петлей и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при температуре 18-28 С. При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной. Контроли антигена а) стабильность - антигенизотонический раствор натрия хлорида. Реакция отрицательная. б) специфичность - антигеннормальная (отрицательная) кроличья сыворотка. Реакция отрицательная. Культура на МПА или среде Минка, давшая положительную реакцию агглютинации с моновалентной антиадгезивной сывороткой и имеющая типичные дляморфологические, тинкториальные и культуральные свойства, считается возбудителем колибактериоза с адгезивным антигеном 41, что является видовым признаком. 4 17486 1 2013.08.30 Титр адгезивного антигена 41 в РДП с моноспецифической анти-41 сывороткой(титр 164) составляет 132-164, что выше полученных результатов в прототипе. Пример 4. Определение иммуногенных свойств штамма бактерийКМИЭВ-98 штамм-антиген. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген культивируют на агаровой питательной среде, далее смывают стерильным физраствором доводя до концентрации 5 млрд. микробных клеток в 1 мл. Инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4 и в качестве адъюванта добавляют 10 -ные алюмокалиевые квасцы в количестве 10 к объему. Далее двукратно, с интервалом 7 дней, иммунизируют белых мышей. Для этого десяти белым мышам штамм-антиген вводят подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяют через 10-14 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью бульонной культуры штамма бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген в тестдозе 0,5 мл. Штамм-антиген считают иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 70 животных, при гибели контрольных 90 и более животных в течение 10 суток после заражения. Пример 5. Определение антигенной активности штамма бактерийКМИЭВ-98 штамм-антиген. Препаратом из штаммаКМИЭВ-98 - штамм-антиген иммунизируют 3-4 кроликов двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 млрд. м.т./мл в объеме 2,0 см 3, с последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых планшетах. Титр антител в сыворотке крови кроликов в РА составлял не ниже 12048, что выше приведенных показателей в прототипе. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5