Способ получения натриевой соли бактериохлорина е6

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВОЙ СОЛИ БАКТЕРИОХЛОРИНА ед(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт молекулярной и атомной физики Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Ничипорович Инна Николаевна Крук Николай Николаевич Кузьмицкий Валерий Александрович Кочубеева Нина Даниловна Мананкина Елена Евгеньевна Мельников Станислав Сергеевич (ВУ)(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт молекулярной и атомной физики Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)Способ получения натриевой соли бактериохлорина ед, включающий выращивание на свету в контролируемых условиях на питательных средах Ормерода, имеющих рН 6,8-7,0,биомассы фототрофных бактерий рода К 11 о 1 о 5 р 1 г 11111 ш шЬгиш или К 11 ос 1 оЬасгег 5 р 11 аегок 1 е 5,ее обработку охлажденной до 15 С смесью 97 об. ацетона и 3 об. метанола, центрифугирование при 3000 3 в течение 15 мин, перевод полученного экстракта бактериохлорофилла а в делительной воронке в гексан, кипячение в отсутствие кислорода воздуха в течение 5-10 мин с 12 -ным этанольным или метанольным раствором ЫаОН до выпадения осадка натриевой соли магниевого комплекса бактериохлорина ед, его эфирнокислотное фракционирование, в ходе которого происходит удаление атома магния из центра порфиринового макроцикла с образованием натриевой соли бактериохлорина ее, и ее выделение.Изобретение относится к области биотехнологии, органической химии, фармакологии,медицины и может быть использовано в фотодинамической терапии раковых опухолей. Бактериохлорин ед относится к классу растительных порфиринов, получаемых на ос нове бактерохлорофилла а . Известно, что растительные порфирины - хлорофилл а , бак терохлорофилл а И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ - ЯВЛЯЮТСЯ фармакологически активными СОЕДИ ВУ 8673 С 12006.12.30нениями И могут быть использованы в медицинской практике, в том числе как фотосенсибилизаторь 1 для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний. Бактериохлорин ед представляет собой сложную молекулу тетрагидропорфиринаИзвестен способ получения триметилового эфира бактериохлорина ед, описанный в 1 и состоящий в том, что раствор бактериохлорофилла а , экстрагированного из бактерийКпобозрцшиш шЬгиш, подвергают вначале кислотному гидролизу и этерификации, с получением промежуточного продукта метилбактериофеофорбида, который впоследствии омыляют слабой щелочью Ва(ОН)2 с получением конечного продукта.Недостатками данного способа являются трудоемкость получения, большие энергетические затраты, затраты химических реактивов и низкий выход конечного продукта.Также ИЗВССТСН СПОСОб ПОЛУЧСНИЯ бактерохлорина а ПУТМ ОМЫЛСНИЯ И КИСЛОТНОГОгидролиза бактериохлорофилла а , экстрагируемого из анаэробных фотосинтетическихНедостатками этого способа получения бактериохлорина ед являются многооперационность и сложность технологического процесса, использование больших количеств коррозионно опасной соляной кислоты, использование дорогостоящего способа очистки конечного продукта посредством жидкостной хроматографии.Кроме того, бактериохлорин может быть получен посредством диимидного восстановления соответствующего порфирина 3.Недостатком такого способа является полностью химический синтез конечного продукта, что влечет соответствующие недостатки больщие затраты химических соединений,больщие энергозатраты, сложность технологического процесса.Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения хлорина ед, описанный в 4 и состоящий в том, что в качестве исходного сырья используют биомассу фототрофных бактерий, выращенную на свету в контролируемых условиях на искусственных питательных средах, имеющих водородный показатель от 8,0 до 12,0, которую обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи сконцентрацией 10-2-10-3 н. Биомассу фильтруют и экстрагируют хлорофилл а этиловым спиртом. На полученный экстракт воздействуют минеральной или органической кислотой, например соляной или уксусной, для образования в реакционной массе феофитина а ,выделяемого фильтрованием и промыванием неполярным органическим растворителем,обычно гексаном. Очищенный феофитин а растворяют и подвергают щелочному гидро лизу, который проводят в отсутствие кислорода, например, в токе азота в спиртовой среде при нагревании. Затем реакционную смесь охлаждают и доводят соляной кислотой до рН 6,О-7,О. Происходит выпадение осадка хлорина ед, который отфильтровывают, промь 1 вают и сущат до постоянного веса. Длинноволновый максимум поглощения данного фо ВУ 8673 С 12006.12.30тосенсибилизатора находится в области 660 нм. По указанному способу без хроматографической очистки получают продукт чистотой не ниже 90 .Недостатком приведенного способа является многостадийность технологического процесса.Задачей данного Изобретения является упрощение способа получения бактерохлорина ее, как сенсибилизатора фотодинамического действия с длинноволновым максимумом поглощения при 750 нм.Предложен способ получения натриевой соли бактериохлорина ед, включающий вь 1 ращивание на свету в контролируемых условиях на питательных средах Ормерода, имеющих рН 6,8-7,0, биомассы фототрофных бактерий рода К 11 о 1 о 5 р 1 г 11111 ш гиЬгиш или КЬОаОЬасгег зрпаегойбез, ее обработку охлажденной до 15 С смесью 97 об. ацетона и 3 об. метанола, центрифугирование при 3000 5 в течение 15 мин, перевод полученногокислорода воздуха в течение 5-10 мин с 12 -ным этанольным или метанольным раствором ЫаОН до выпадения осадка натриевой соли магниевого комплекса бактериохлорина ее, его эфирно-кислотное фракционирование, в ходе которого происходит удаление атома магния из центра порфиринового макроцикла с образованием натриевой соли бактериохлорина ед, и ее выделение.Биомассу фототрофных бактерий рода Кпобозрйгшиш гиЬгиш выращивают в закрытом стеклянном термостате с г 28-30 С в условиях искусственного освещения на жидкой питательной среде Ормерода 5, представляющей собой водный раствор солей, содержащих макро- и микроэлементы, необходимые для интенсивного культивирования фототрофных бактерий. Питательная среда имеет рН 6,8-7,0. После 10 дней роста биомассу бактерий отделяют от питательной среды путем центрифугирования при 5000 5 в течение 5 мин и получают, например, 300 г осадка. Указанное количество осадка обрабатывают 660 мл смеси полярных растворителей ацетона и метилового спирта (97 и 3 об. соответственно) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 мин при 15 С. Затем образцы центрифугируют при 3000 5 в течение 15 мин и отбирают содержащий пигменты супернатант. В делительной воронке пигмент переводят в гексан (300 мл) и отмывают от метанола и ацетона 3 или 4 раза дистиллированной водой. Выход бактериохлорофилла а0,5 г. К бактериохлорофиллу а в гексане добавляют 240 мл 12 -ной щелочи ЫаОН в ме тиловом спирте. Смесь кипятят под вакуумом, который создается водоструйным насосом,в течение 10 мин. Натриевая соль магниевого комплекса бактериохлорина ед выпадает в осадок. Раствор охлаждают и нейтрализуют соляной кислотой НС 1, добавив 75 мл концентрированной НС 1. Каротиноиды, находящиеся в легкой фракции растворителей, удаляют. Остаток подвергают кислотно-эфирному фракционированию. 5 -ную фракцию НС 1 переводят в свежий эфир, отмывают водой, сушат и выпаривают. Выход конечного продукта составляет 0,34 г.100 г замороженной биомассы бактерий КпобоЬасгег зрпаетойбез, выращенных, как указано в примере 1, заливают 220 мл смеси ацетона и метилового спирта (его количество составляет 7 мл), перемешивают, Центрифугируют, а затем декантируют и помещают в делительную воронку. В делительной воронке пигмент переводят в гексан (100 мл) и от мь 1 вают ОТ метанола И ацетона дистиллированной ВОДОЙ. ВЫХОД бЗКТСРИОХЛОРОфИЛЛЗ а0,17 г. К бактериохлорофиллу а в гексане добавляют 80 мл 12 -ной щелочи ЫаОН в эти ловом спирте. Смесь кипятят в токе азота в течение 5 мин. В ходе реакции образуется натриевая соль магниевого комплекса бактериохлорина ее, которая выпадает в осадок. В раствор добавляют 41 мл концентрированной НС 1, нейтрализуя его и доводя концентрацию соляной кислоты до 5 . Под действием кислоты из центра макроцикла удаляетсяатом магния, бактериохлорин ед переходит в 5 -ную НС 1, а каротиноидь 1 остаются в легкой фракции растворителей. Каротиноидь 1 удаляют, а бактериохлорин ее очищают путем эфирно-кислотного фракционирования, собирают и высушивают. Выход конечного продукта 0,1 г.Таким образом, полученный из бактериального сырья бактериохлорофилльнь 1 й пигмент Бхл ее обладает всеми достоинствами фотосенсибилизаторов на основе Хл ед хорошей растворимостью в водных средах и накоплением в опухолевых тканях с высоким контрастом. Вместе с тем, благодаря значительному сдвигу полосы поглощения сенсибилизатора в длинноволновую область (7 ьм 750 нм) он имеет существенные преимущества как по увеличению глубины проникновения возбуждающего света в ткани, так и по уменьшению дозовой нагрузки.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.