Способ получения препарата для иммунокоррекции

(51)61 35/74, 39/112 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ(71) Заявители Зайцева Алеся Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович(72) Авторы Зайцева Алеся Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович(73) Патентообладатели Зайцева Алеся Владимировна Дремач Геннадий Эдуардович(57) Способ получения препарата для иммунокоррекции, включающий выделение полисахаридного антигена из сальмонелл, отличающийся тем, что биомассу сальмонелл обрабатывают ацетоном в течение 24-60 часов при температуре 4-20 С и массовом соотношении 13, биомассу отделяют от ацетона, полисахаридный антиген экстрагируют 0,5-1,0 -ным раствором аммиака в течение 60-100 минут при температуре 90-105 С,центрифугируют и в центрифугат добавляют до 0,5-1,0 тиосульфат натрия. Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к способу получения иммуностимулятора из соматических антигенов сальмонеллезных бактерий. Широко известны способы получения иммуностимулирующих препаратов из компонентов бактериальных клеток детоксицированного липополисахарида из нейсерий 1 липополисахарид из биомассы авирулентного штамма .выделяют вводно-фенольной экстракцией при температуре 65 С по способу . , .8 и очищают гельфильтрацией на сефадексе -200 4 липополисахарид получают путем экстракции бактерий трихлоруксусной кислотой 5 липополисахарид из биомассы В.штамма 475 выделяют по методу .. 7 и очищают путем трехкратного переосаждения и дальнейшего центрифугирования при 15000 д в течение двух часов 6 липополисахарид из биомассы пуллорных бактерийштамма 24 выделяют путем экстракции биомассы бактерий 0,5 -ным раствором аммиака при температуре 80 С в течение 60 минут и последующей обработки экстракта формализированными эритроцитами в соотношении 11 2. 7787 1 2006.02.28 Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является способ получения биологически активного препарата из сальмонелла тифи 3. Этот препарат представляет собой полисахаридную фракцию соматического О-антигена бактерий брюшного тифа, который получают путем депротеинизации фенольного антигена с последующим удалением липида А при гидролизе в ацетате. Однако, препарат, полученный из биомассы сальмонелла тифи, обладает высокой токсичностью и низкой биологической активностью. Задача изобретения - увеличение биологической активности целевого продукта и снижение его токсичности. Поставленная цель достигается тем, что биомассу сальмонелл обрабатывают ацетоном, экстрагируют 0,5-1,0 -ным раствором аммиака. Экстракт получают в течение 60-120 минут, центрифугируют, а в полученном продукте ресуспендируют тиосульфат натрия. Сущность изобретения. Способ получения препарата для иммунокоррекции, предусматривающий обработку биомассы бактерий, выделение полисахаридсодержащего антигена, очистку продукта и его стабилизацию, отличающийся тем, что предварительно биомассу сальмонелл инкубируют в ацетоне в течение 24-60 часов при температуре 4-20 С и соотношении ингредиентов (вес. ) 13, обрабатывают 0,5-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 90-105 С в течение 60-100 минут, полученный экстракт центрифугируют и смешивают с тиосульфатом натрия в соотношении ингредиентов (вес. ) 1001-2001. Пример 1 Сальмонеллезные бактерии выращивают на питательной среде, содержащей в качестве белковой основы водный и кислотно-ферментативный гидролизат мясокостной муки, а в качестве стимулятора роста - щелочно-перекисный гидролизат сыворотки крови животных. Полученную биомассу бактерий отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования. Биомассу сальмонелл инкубируют в ацетоне в течение 24 часов при температуре 4 С и соотношении ингредиентов 13. Биомассу, отделенную от ацетона, ресуспендируют в 1 -ном растворе аммиака. Щелочной гидролиз осуществляют при температуре 105 С в течение 60 минут. Экстракт центрифугируют, а в полученный гидролизат добавляют до 0,5 тиосульфата натрия. Препарат при внутрибрюшинном введении не вызывал гибель белых мышей. Препарат, инъецированный поросятам опытной группы в дозе 500 мкг/кг массы двукратно,обеспечивал увеличение количества лейкоцитов в 2,3 раза в сравнении с аналогичными показателями у животных контрольной группы. Пример 2 Способ осуществляли аналогично примеру 1, но биомассу сальмонелл инкубируют в ацетоне в течение 60 часов при температуре 20 С. У поросят опытной группы после двух инъекций препарата в дозе 500 мкг/кг массы отмечалось увеличение количества лейкоцитов в 2,2 раза по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Препарат в дозе 0,5 см 3 при внутрибрюшинном введении не вызывал гибель белых мышей. Пример 3 Способ осуществляли аналогично примеру 1, но биомассу, отделенную от ацетона,инкубируют в 0,5 -ном растворе аммиака при температуре 90 С в течение 100 минут. При двукратной инъекции препарата в дозе 500 мкг/кг массы поросят отмечалось увеличение лейкоцитов в 2,1 раза. Препарат в дозе 0,5 см 3 не вызывал гибель белых мышей. 2 7787 1 2006.02.28 Пример 4 Способ осуществляют аналогично примеру 1, но сальмонеллезные бактерии выращивают на питательной среде, содержащей в качестве белковой основы гидролизат белков сыворотки молока, а полученную биомассу бактерий после отделения от культуральной жидкости инкубируют в ацетоне в течение 24 часов при температуре 4 С и соотношении компонентов 12. При двукратной инъекции препарата в дозе 500 мкг/кг массы поросят выявлено увеличение лейкоцитов в 1,7 раз. Препарат в дозе 0,4 см 3 вызывал гибель белых мышей. Пример 5 Способ осуществляют аналогично примеру 1, но сальмонеллезные бактерии, выращенные на питательной среде из гидролизатов белков крови и отделенные от культуральной жидкости, инкубируют в ацетоне при соотношении компонентов 14. Препарат в дозе 0,4 см 3 вызывал гибель белых мышей. Содержание лейкоцитов увеличивалось в 1,6 раза после двукратного введения препарата поросятам в дозе 500 мкг/кг массы животных. Пример 6 Способ осуществляют аналогично примеру 1, но биомассу бактерий обрабатывают 0,3 -ным раствором аммиака при температуре 100 С. Препарат в дозе 0,5 см 3 вызывал гибель белых мышей. Содержание лейкоцитов увеличивалось в 1,56 раза после двух инъекций препарата поросятам в дозе 500 мкг/кг массы животных. Пример 7 Способ осуществляют аналогично примеру 1, но биомассу бактерий обрабатывают 1,2 -ным раствором аммиака при температуре 95 С в течение 60 минут Препарат в дозе 800 мкг/кг массы вызывал увеличение содержания лейкоцитов у поросят в 1,47 раза. Пример 8 Способ осуществляли аналогично примеру 1, но в полученный гидролизат добавляют до 1,0 тиосульфата натрия. Препарат, введенный внутрибрюшинно в дозе 0,5 см 3 белым мышам, не вызывал гибель животных. Целевой продукт в дозе 500 мкг/кг массы поросят обеспечивал повышение уровня лейкоцитов в 2,4 раза. Пример 9 Способ осуществляли аналогично примеру 1, но в полученный гидролизат добавляют до 1,2 тиосульфата натрия. Препарат, веденный в дозе 500 мкг/кг массы, обеспечивал увеличение уровня лейкоцитов у поросят в 1,72 раза. Препарат в дозе 0,5 см 3 вызывал гибель белых мышей. Пример 10 Способ осуществляли аналогично примеру 1, но в полученный гидролизат добавляют до 0,3 тиосульфата натрия. Препарат в дозе 0,4 см 3 вызывал гибель белых мышей. 7787 1 2006.02.28 Препарат, веденный в дозе 500 мкг/кг массы, обеспечивал увеличение уровня лейкоцитов у поросят в 1,9 раза. Из полученных данных видно, что при изготовлении иммуностимулятора биомассу сальмонелл следует обрабатывать ацетоном в соотношении 13 в течение 24-60 часов при температуре 4-20 С. Биомассу сальмонелл далее следует ресуспендировать в 0,5-1,0 ном растворе аммиака и инкубировать при температуре 90-105 С в течение 60-100 минут. Экстракт необходимо центрифугировать, а полученный продукт смешивать с тиосульфатом натрия в соотношении 1001-2001. Препарат, изготовленный при вышеуказанных режимах, обеспечивал при обработке им поросят увеличение уровня лейкоцитов в 2,2-2,4 раза. Препарат в дозе 0,5-0,55 см 3 при внутрибрюшинном введении был не токсичен для белых мышей. Обработка биомассы сальмонелл ацетоном в соотношении 12 или 14 повышала токсичность препарата, а у иммунизированных животных обеспечивала увеличение содержания лейкоцитов в 1,6-1,7 раза. Обработка биомассы сальмонелл 0,3 -ным и 1,2 -ным раствором аммиака повышала токсичность препарата для животных, а полученный препарат увеличивал содержание лейкоцитов в крови опытных поросят только в 1,47-1,56 раза. Снижение концентрации тиосульфата натрия в препарате до 0,3 способствовало увеличению его токсичности, а увеличение до 1,2 снижало биологическую активность препарата. Источники информации 1. Дельвич А.А., Краснопрошина Л.И., Бобылева Г.В., Кувакина В.И. Протективная активность детоксицированного липополисахаридасерогруппы А в опытах// Журнал микробиология. - 1989. -5. - С. 70. 2. Заявка на изобретение 19980808. Способ получения препарата для иммунокоррекции / Зайцев В.В., Карпуть И.М., Бабина М.П. и др. // Афцыйны бюлетэнь. - 1999. -1 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.