Способ получения препарата для иммунокоррекции

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ(73) Патентообладатель Зайцев Владимир Владимирович, Карпуть Иван Матвеевич, Бабина Мария Павловна,Ковзов Владимир Владимирович, Прощенко Виктор Михайлович(57) Способ получения препарата для иммунокоррекции, предусматривающий экстракцию биомассы бактерий и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию биомассы проводят из бактерий- штамм 24 КСТ 0,5 -ным раствором аммиака при температуре 80 С в течение 60 мин, затем инкубируют смесь экстракта и формалинизированных эритроцитов барана, взятых в соотношении 11, при температуре 80 С в течение 60 мин, и отделяют адсорбированный экстракт от эритроцитов путем центрифугирования при 3000 об./мин. Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу получения иммуномодулятора из биомассы сальмонеллезных бактерий. Известен способ получения иммуномодулятора, в частности сальмозана-О-антигена .1,4. Сальмозан готовят водно-фенольным методом с последующим осторожным гидролизом уксусной кислотой 2. Описан способ получения ЛПС из авирулентного штамма 6, выделенный водно-фенольной экстракцией при 65 С по методу . с соавторами 6 и очищенный гельфильтрацией на сефадексе-200 3. ЛПС из бактерий . штамма 475 выделен по методу . с соавторами 6 и очищен путем трехкратного переосаждения и дальнейшего центрифугирования при 150000 в течение двух часов 5. Наиболее близким к изобретению является способ получения биологически активного препарата из сальмонелла тифи 2. Однако препарат, полученный из биомассы сальмонелла тифи, обладает высокой токсичностью и реактогенностью. Кроме того, выход целевого биологического продукта из сальмонелла тифи низкий. Задача изобретения - увеличение выхода целевого продукта, снижение его токсичности и упрощение способа получения. Поставленная цель достигается тем, что биомасса пуллорных бактерийштамм 24 КСТ экстрагируется 0,5 -ным раствором аммиака. Полученный экстракт центрифугируют при 9 тыс. об./мин и обрабатывают формализированными эритроцитами барана. Сущность изобретения. Способ получения иммуномодулятора, предусматривающий экстракцию биомассы бактерий и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию биомассы проводят из бактерий- штамма 24 КСТ 0,5 -ным раствором аммиака при температуре 80 С в течение 60 мин, за 4371 1 тем инкубируют смесь экстракта и формалинизированных эритроцитов барана, взятых в соотношении 11, при температуре 80 С в течение 60 мин и отделяют адсорбированный экстракт от эритроцитов путем центрифугирования при 3000 об./мин. Пример 1. Пуллорных бактерий выращивают на двухкомпонентной среде из гидролизатов белков крови. Полученную биомассу бактерий отделяют от питательной среды путем центрифугирования при 9 тыс. об./мин. 0,5 ным раствором аммиака. Гидролиз бактериальной суспензии пуллорных бактерий осуществляют при температуре 80 С в течение 60 мин. Экстракт освобождают от бактериальных клеток путем центрифугирования при 9 тыс. об./мин и смешивают с формализированными эритроцитами барана в соотношении 11. Смесь инкубируют при 80 С в течение 60 минут. Адсорбированный экстракт из пуллорных бактерий отделяют от эритроцитов путем центрифугирования при 3 тыс. об./мин. Полученный препарат расфасовывают в стеклянные флаконы, герметично укупоривают и стерилизуют текучим паром. Выход целевого продукта составляет 11,4 от исходной биомассы пуллорных бактерий. Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в 0,4 -ном растворе аммиака. Выход целевого продукта составляет 29,0 . Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в 0,6 -ном растворе аммиака. Выход целевого продукта составляет 19,2 . Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в 0,5 -ном растворе аммиака при температуре 85 С. Биологическая активность целевого продукта снижается на 22 . Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в 0,5 -ном растворе аммиака при температуре 75 С. Биологическая активность целевого продукта снижается на 42 . Пример 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но экстракт адсорбируют эритроцитами в соотношении 1,01,5. Выход целевого продукта снижается на 34 . Пример 7. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но экстракт адсорбируют эритроцитами в соотношении 1,00,5. Токсичность целевого продукта повышается на 72 и он не пригоден для практического применения. Пример 8. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассу пуллорных бактерий производят при температуре 80 С в течение 50 минут. Выход целевого продукта составил 8,6 . Пример 9. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят при температуре 80 С в течение 70 минут. Выход целевого продукта составил 8,4 . Экспериментально установлено, что как снижение до 0,3 , так и повышение до 0,5 концентрации аммиака приводит к снижению выхода целевого продукта. При гидролизе биомассы пуллорных бактерий выше или ниже температуры 80 С отмечается снижение биологической активности целевого продукта на 22-42 . Снижение концентрации эритроцитов при адсорбции экстракта в два раза приводит к резкому повышению токсичности препарата, а повышение в 15 раза к снижению выхода целевого продукта. Таким образом, использование предложенного способа получения иммуномодулятора позволит расширить арсенал лечебных препаратов в ветеринарии и медицине. Пример 10. Полученный иммуномодулятор-полисахарид используют телятам в дозе 0,1 мл/кг массы двукратно с интервалом семь дней. Сравнительная оценка эффективности применения полисахарида по сравнению с известным препаратом этой группы пирогеналом проводилась в комплексной терапии больных энзоотическим зобом. Телятам первой подопытной группы однократно внутримышечно вводили иммуномодулятор в дозе 0,1 мл/кг массы внутримышечно. Животным второй подопытной группы в возрастающих дозах внутримышечно вводили пирогенал в течение четырех дней в возрастающих дозах 1,5 3,5 и 5 мкг на животное. Результаты исследований показывают, что оба препарата профилактируют иммунодефицитное состояние, однако более выраженное стимулирующее влияние на показатели естественной резистентности и иммунной реактивности отмечается от применения полученного препарата (табл. 1, 2). Так у телят, обработанных указанным препа 2 4371 1 ратом, была выше фагоцитарная активность нейтрофилов и содержание иммуноглобулинов. Одновременно возрастали среднесуточные приросты живой массы на 125 г. Пример 11. Препарат используют поросятам парентерально в дозе 0,1 мл/кг массы двукратно с интервалом семь дней для профилактики иммунодефицитного состояния и гастроэнтеритов. С этой целью первой группе животных в дозе 0,1 мг/кг живой массы двукратно с интервалом семь дней вводили полученный полисахарид. Второй подопытной группе (контрольной) применяли внутримышечно пирогенал трехкратно с интервалом три-четыре дня в дозах 2,5 5,0 10 мкг на животное. Использование полисахарида достоверно способствовало повышению показателей естественной резистентности и иммунной реактивности, снижению заболеваемости поросят с симптомами диареи (табл. 3). Пример 12. Подопытным цыплятам выпаивали препарат в дозе 0,5 мл в двенадцатидневном возрасте и 1 мл в 19 дневном возрасте. Сроки применения препарата подобраны с учетом иммунологической перестройки цыплят. Цыплята контрольной группы препарат не получали. Полученные результаты показывают, что новый микробный полисахарид при энтеральном способе применения оказывает выраженный и длительный стимулирующий эффект. У цыплят отмечается достоверное повышение количества лейкоцитов за счет Т-, потом В-лимфоцитов, усиливается фагоцитарная активность псевдоэозинофилов, лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови, увеличивается содержание иммуноглобулинов за счет класса А и . Снижается заболеваемость цыплят болезнями с диарейным синдромом. Таблица 1 Клеточные факторы иммунной защиты телят (, Р) Показатели Примечание 1 - телята, обработанные микробным полисахаридом 2 - телята, обработанные пирогеналом 3 - телята контрольной группы- уровень значимости критерия достоверности Р 0,05- Р 0,1 (к 1-й группе). Таблица 2 Гуморальные факторы иммунной защиты телят (, Р) Показатели Бактерицидная активность сыворотки крови,Лизоцимная активность сыворотки крови,Общий белок сыворотки крови, г/л Иммуноглобулины, г/л Иммуноглобулин М, г/л Примечание 1 - телята, обработанные микробным полисахаридом 2 - телята, обработанные пирогеналом 3 - телята контрольной группы- уровень значимости критерия достоверности Р 0,05- Р 0,1 (к 1-й группе). 4371 1 Таблица 3 Показатели иммунного статуса и заболеваемость поросят(исследования через 7 дней от последнего применения препаратов) Показатели Лейкоциты, /109 Лимфоциты,Общий белок, г/л Иммуноглобулины,Иммуноглобулины М,Гаптоглобины,Бактерицидная активность сыворотки крови,Заболеваемость,Примечание 1 - поросята, обработанные микробным полисахаридом 2 - поросята, обработанные пирогеналом 3 - контрольные поросята. Источники информации 1. Дельвич А.А., Краснопрошина Л.И., Бобылева Г.В., Кувакина В.И. Протективная активность детоксицированного липополисахаридасерогруппы А в опытах//Журнал микробиологии. - 1989. -5 .- С. 70. 2. Киржаев Ф.С., Бурмистрова Т.И. А. с. СССР 594173, кл. С 12 К 1/00, А 61 К 39/02. - 1975. -Опубл. 25.02.78. Бюл.7. 3. Тараненко Т.М., Дальвадяну С.М., Бахрах Е.Э. //Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1972. Вып. 3 (25). - С.93-98. 4..,. // . .- 1933. - . 144. - .307-310. 5..,.,.. // . . . - 1985. - . 151. - . 399-404. 6. //. . . - 1965. - .5. - . 92-95. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 4