Способ получения 125I-меченных биополимеров

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Макаренко Михаил Васильевич Дрожденюк Анатолий Павлович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ получения 125-меченных биополимеров, включающий радиоиодирование биополимера в присутствии хлорамина Т и остановку реакции восстановителем, отличающийся тем, что вначале проводят преинкубацию 125 и хлорамина Т, после чего в реакционную смесь добавляют биополимер, а в качестве восстановителя используют метионин в количестве, эквимолярном количеству хлорамина Т. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что преинкубацию проводят в течение 0,15,0 мин. Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к усовершенствованному способу получения 125-меченных белков, иммуноглобулинов и нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в качестве радиомаркеров в радиоиммунологическом анализе (РИА). Известен способ получения 125-меченных препаратов окислительным радиоиодированием с использованием хлорамина Т (ХАТ) 1. Радиоиодирование инициируют внесением раствора ХАТ, перемешивают в течение минуты и останавливают прибавлением раствора метабисульфита натрия (МБС), используя его 4-кратный избыток по отношению к ХАТ или даже 8,9-кратный избыток МБС 2. Эффективность включения изотопа 60-75 . Этот способ требует применения значительных избытков окислителя и восстановителя,что приводит к нежелательным побочным реакциям - модификации некоторых аминокислот, образованию агрегатов. Такое разрушение физикохимической целостности иодируемых веществ уменьшает их биологическую и иммунологическую активность, делает не 6303 1 адекватным связывание меченого и немеченого лигандов 3. Уменьшение количества ХАТ не устраняет эти недостатки 4, при этом снижается эффективность включения изотопа, время реакции возрастает до 10 минут и, соответственно, увеличивается время окислительного воздействия ХАТ на биополимер. Наряду с этим увеличение времени реакции свыше 5 минут приводит к нежелательному образованию в реакционной смеси иодатов 125 3- 5. Используемый избыток восстановителя также не исключает модификации маркера - стабильность и иммунохимические свойства получаемых меченых препаратов снижаются, что затрудняет использование их в РИА 6. Если не вносить восстановитель в реакционную смесь, то увеличивается как окисление целевого продукта, так и неконтролируемое иодирование белка-носителя и сефадекса, используемых для хроматографии 7. В водных растворах МБС существует в форме НО 3 ионов, нежелательное восстановительное действие которых показано на ряде белков 8. При радиоиодировании нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов, содержащих цитозин, использование МБС вызывает их дезаминирование до 689. Известно также, что 131-меченные производные урацилов разрушались немедленно в присутствии тиосульфата или сульфита 10. Наиболее близким к заявляемому является способ 11. Способ заключается в том, что в реакционную ампулу последовательно вносят растворы 125, белка и ХАТ. Реакционную смесь перемешивают. Останавливают реакцию прибавлением раствора цистеина. Эффективность включения изотопа составляет 49,1 . Использование цистеина с его высокореакционной -группой (в форме меркаптидного -иона является сильным нуклеофилом) способствует ряду побочных реакций. Наличие избытка -групп приводит к разрушению - связей белков, что способствует их денатурации. Окисление цистеина приводит к образованию дисульфида цистина, способного через реакцию дисульфидного обмена образовывать смешанные дисульфиды с белками. В щелочной и нейтральной среде реакция катализируется -ионами. Задачей изобретения является усовершенствование способа получения 125-меченных биополимеров, уменьшение побочных реакций окислительного воздействия ХАТ и восстановительного воздействия стоп-реагента, разработка способа, подходящего для различных классов биополимеров. Поставленная задача решается заявляемым способом, который заключается в том, что вначале проводят преинкубацию 125 и хлорамина Т,после чего в реакционную смесь добавляют биополимер, а в качестве восстановителя используют метионин в количестве, эквимолярном количеству хлорамина Т. При этом преинкубацию проводят в течение 0,1-5,0 мин. Установлено, что изменение порядка внесения реагентов, а именно внесение биополимера в реакционную смесь после преинкубации реагентов (т.е. образование активной формы иодирующего агента в реакционной смеси в отсутствии биополимера) и использование в качестве стоп-реагента эквимолярных количеств восстановителя (метионина) позволяет получать высококачественные маркеры связывание с избытком антител составляет 92-99 . Способ позволяет использовать меньшие количества окислителя (1-3 мкг), так как уменьшается его расход на побочные реакции с легкоокисляемыми группами биополимеров. Преинкубация также способствует уменьшению времени иодирования при высокой эффективности включения изотопа. При прочих равных условиях предлагаемый способ позволяет увеличить эффективность включения изотопа в 1,3-2,5 раза по сравнению с традиционным способом при использовании одинаковых количеств окислителя и времени реакции. Реакционная способность тиоэфирной группы используемого метионина существенно отличается от реакционной способности 3- и -групп. Однако она достаточно легко взаимодействует с ХАТ. Метионин и продукты его окисления в отличие от метабисульфита натрия и цистеина не взаимодействуют с иодируемыми молекулами биополимеров. Заявляемый способ поясняется примерами конкретного получения 125-маркеров. 2 6303 1 Пример 1. Получение 125-меченной кислой фосфатазы предстательной железы человека (125 КФП). В коническую пробирку Эппендорфа (с пробкой, объем 1,5 мл) вносят 20 мкл 0,1 М натрий фосфатного буфера (НФБ), рН 7,5, 3 мкл (40 МБк) 125 и 10 мкл (1 мкг) свежеприготовленного раствора ХАТ в 0,1 М НФБ. Интенсивно перемешивают 3 мин на встряхивателе пробирок (1292, , Швеция). Прибавляют 20 мкл (40 мкг) кислой фосфатазы, перемешивают 10 с. Реакцию останавливают прибавлением 10 мкл (0,53 мкг) метионина. Разбавляют реакционную смесь 150 мкл 0,05 М НФБ, содержащего 0,15 Ми 0,033. Реакционную смесь наносят на колонку с -гелем -55 (145 см), уравновешенную 0,05 М НФБ, содержащим 0,1 бычьего сывороточного альбумина(БСА), 0,15 Ми 0,033. Элюирование проводят этим же буфером со скоростью 6 мл/ч. Фракции по 0,5 мл собирают на коллекторе фракций 2112. Из фракций отбирают аликвоты по 10 мкл и просчитывают их активность на гамма-счетчике 1274 фирмы . Методом осаждения водным раствором 20 -ной трихлоруксусной кислоты определяют фракции, содержащие 125-КФП. Эффективность включения изотопа составила 64,0 . В этих же условиях без преинкубации включение равно 25,3 . Качество получаемых радиоактивномеченных препаратов оценивали по связыванию с избытком антител. Иммунореактивность составляла 92-98 . Пример 2. Получение 125-альфа субъединицы хорионического гонадотропина человека (125-альфа ХГ). В пробирку Эппендорфа вносят 10 мкл 0,1 М НФБ рН 7,5, 3 мкл (40 МБк) 125 и 10 мкл (2 мкг) свежеприготовленного раствора ХАТ. Интенсивно перемешивают 60 с. Прибавляют 10 мкл (10 мкг) альфа ХГ, перемешивают 15 с. Реакцию останавливают прибавлением 10 мкл (1,1 мкг) метионина. Разбавляют реакционную смесь 150 мкл 0,05 М НФБ, содержащего 0,15 М , 0,1 и 0,033. Целевой продукт выделяют методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом 50 (145 см). Эффективность включения изотопа составила 91,4(в этих же условиях,без преинкубации включение равно 56 ). Иммунореактивность 125-альфа ХГ составляла 97-99 . Пример 3. Получение 125-меченного аденозин-3,5-циклофосфат-2-О-сукцинилтирозинметилового эфира (125). В пробирку Эппендорфа вносят 20 мкл 0,1 М НФБ рН 7,0, 3 мкл (40 МБк) 125 и 10 мкл (3 мкг) свежеприготовленного ХАТ. Интенсивно перемешивают 20 с. Прибавляют 10 мкл (5 мкг) -, перемешивают 10 с. Реакцию останавливают внесением 10 мкл (1,6 мкг) метионина в 0,1 М НФБ. Реакционную смесь разбавляют 100 мкл 0,1 в 0,05 М КН 2 РО 4 буфере рН 4,5. Выделяют целевой продукт методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе , на колонке, заполненной сорбентом(4,6250 мм) в градиенте концентрации метанола (0-70 ) в 0,005 М КН 2 РО 4 буфере рН 4,5. Эффективность включения изотопа 94,3 . Без преинкубации выход составлял 72 . Связывание с антителами к циклическому аденозинмонофосфату составило 98,5 . Источники информации 1., // , 1962. - . 194. - о 4827. - . 495-496. 2.4529713, 1985. 3 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.