Способ определения госпитальных штаммов золотистого стафилококка

12 1/20 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА(71) Заявитель Витебский государственный медицинский институт(72) Авторы Генералов Игорь Иванович Генералова Анжелика Геннадьевна Занько Сергей Николаевич(73) Патентообладатель Витебский государственный медицинский институт(57) Способ определения госпитальных штаммов золотистого стафилококка, включающий посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования, коагулазы и лецитиназы, отличающийся тем, что дополнительно проводят количественную оценку гиалуронидазной активности штамма и при определении уровня гиалуронидазы выше 0,5 МЕ относят выделенный штамм к госпитальным.(56) Акатов А.К., Зуева В.С. Стафилококки. - М. Медицина, 1983. - С. 53-78. Министерство здравоохранения СССР. Приказ 535. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. - М., 1985. - С. 45-56.1611933 1, 1990.1258828 1, 1986.1442542 1, 1988. Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано для идентификации госпитальных штаммов золотистого стафилококка. В настоящее время в клинико-микробиологической практике все чаще возникает необходимость ускоренной идентификации госпитальных штаммов золотистых стафилококков. Это связано с тем, что данные штаммы обладают широким спектром ферментов инвазии и агрессии 1,3, а также множественной лекарственной устойчивостью (например - метициллинрезистентностью 7. Такие эковары возбудителя являются весьма частой причиной вспышек внутрибольничных стафилококковых инфекций (в частности - в учреждениях родовспоможения). Быстрое предварительное определение госпитальных вариантов . создало бы возможности для раннего проведения комплекса лечебнопрофилактических мероприятий, направленных на предупреждение внутрибольничной стафилококковой инфекции. 4964 1 Прототипом нашего способа послужил существующий в настоящее время комплекс микробиологических методов, используемый для идентификации и дифференциации госпитальных штаммов стафилококков. Он включает определение чувствительности штамма к широкому спектру антибиотиков и антисептиков, фаготипирование, определение стафилоцинов 1. В крупных специализированных бактериологических учреждениях эти исследования дополняются генетическими методами. С их помощью у выделенных штаммов определяют гены и их мутации, ответственные за антибиотикоустойчивость (синтез беталактамаз, пенициллинсвязывающих белков и т.д. 7. Методы первой группы длительны, требуют значительного расхода реагентов, время выдачи окончательного ответа растягивается на 4-5 дней. Генетические же методы весьма сложны, требуют дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. С помощью предлагаемого способа сокращается время обнаружения и повышается достоверность определения госпитальных штаммов золотистого стафилококка. Сущность предложения заключается в посеве исследуемого материала на желточносолевой агар, последующей микроскопией и количественным определением гиалуронидазы золотистого стафилококка в течение последующего дня исследования. Определение гиалуронидазы возбудителя достигается обнаруженной нами способностью 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактата (риванола) образовывать сгусток с гиалуроновой кислотой обратно пропорционально ее деполимеризации под действием стафилококковой гиалуронидазы. В случае обнаружения у выделенного штамма . гиалуронидазной активности свыше 500 у.е. делают вывод о принадлежности данного штамма к госпитальным. Примеры осуществления способа. Материалом для микробиологического исследования являются стафилококки, выделенные из патологического материала. Идентификацию видов стафилококков проводят согласно указаниям 535 приказа Минздрава СССР от 22.04.85 г. 4. (Всего на гиалуронидазную активность нами было обследовано 93 штамма Из них от медперсонала было выделено 35 штаммов, от беременных - 48 и от студентов - 9). Концентрацию микроорганизмов оценивают турбидиметрически при длине волны 600 нм, сравнивая со стандартом мутности в 5 усл.ед., обладающим поглощением при спектрофотометрии (длина волны - 600 нм) равным 0,175. Для реакции используют гиалуроновую кислоту производства предприятия Диалек(г. Минск) или получают по методу, предложенному НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи 2. Концентрацию ГК оценивают по способу 5 с карбазоловым реактивом по глюкуроновой кислоте. С целью упрощения методики стандартизацию препарата осуществляют по оптической плотности риванолового сгустка. В реакции используют гиалуроновую кислоту при оптической плотности сгустка 0,27-0,35 при спектрофотометрии при 410 нм (в случае ФЭК-метрии - в 2 раза меньше). Обычно препарат необходимо разводить в соответствующее число раз дистиллированной водой. Калибровочную кривую строят по коммерческому препарату стрептококковой гиалуронидазы с известной активностью (производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Реакцию производят на 0,017 М фосфатном буфере, содержащем 0,0375 М . Для приготовления суспензии микробов берут две-три петли выделенной чистой культуры золотистого стафилококка или несколько его колоний. Суспендируют в физиологическом растворе. Измеряют оптическую плотность взвеси на спектрофотометре при длине волны 600 нм и приводят ее к значению 0,2 физиологическим раствором. Для каждой культуры бактерий готовят 4 центрифужные пробирки. В них предварительно вносят по 0,2 мл стандартизованного препарата гиалуроновой кислоты и 0,1 мл буфера. Затем в соответствующие пробирки добавляют 0,1, 0,02, 0,004 и 0,0008 мл взвеси микробов. В последних трех пробах объем доводят до 0,4 мл физиологическим раствором,2 4964 1 получая тем самым 5-кратные разведения. В качестве контроля используют буфер. Эту пробу дублируют. Инкубируют смесь в течение 2 ч в термостате при 37 С. Затем в пробы вносят 0.1 мл (1/4 часть объема) 20 раствора Тритона -305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнатной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема) 1 раствора риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают вторично для образования сгустка. При избыточном содержании фермента сгусток в первых разведениях не образуется. Пробу с начальным сгустком отбирают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сливают, образец однократно отмывают дистиллированной водой. Далее к нему добавляют 0,5 мл смеси равных объемов 1 н НС 1 и концентрированной серной кислоты. Для экстракции хромогена пробы прогревают при -100 в течение 5-10 мин. После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и оценивают. Определение проводят либо фотоэлектроколориметрически (3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо спектрофотометрически (длина волны - 410 нм, толщина слоя - 1 см). Измерения проводят против дистиллированной воды. Далее проводят оценку содержания гиалуронидазной активности в 1 мл взвеси микроба в следующем порядке. 1). Определяют количество гиалуронидазы в опытных дозах, соответствующее полученной величине оптической плотности (по калибровочному графику, выстроенному предварительно по стрептококковой гиалуронидазе). 2). Измеренную гиалуронидазную активность (в опытных дозах) умножают на разведение и приводят к 1 мл (множитель - 10, 50, 250 и 1250 для 1-4 пробы соответственно). 3). Результат переводят из опытных доз гиалуронидазы в международные единицы. Множитель пересчета - 0,72 - определен для стрептококковой гиалуронидазы по методу турбидиметрии 5. 4). С целью более удобного использования полученные величины умножают на 1000,выражая в условных единицах (у.е.) 1 у.е.0,001 . Полученные нами данные по определению гиалуронидазной активности . отражены в таблице. Гиалуронидазная активность стафилококков (Мт, у.е.) Источник выделения штамма Гиалуронидазная активность, у.е. Медперсонал 982,743216,05535 Беременные 462,271145,3748 Студенты 222,0113,249 Примечание сравнительный анализ уровней гиалуронидазной активности показал,что штаммы золотистого стафилококка, продуцирующие гиалуронидазу в количестве свыше 0,5(500 УЕ), достоверно чаще (0,01) встречаются у возбудителей, выделенных от медперсонала. Это позволяет отнести такие штаммы к госпитальным. В случае обнаружения штамма с гиалуронидазной активностью свыше 500 у.е. делают вывод о его принадлежности к госпитальным эковарам. Эффективность способа. Предлагаемый способ ускоряет и упрощает обнаружение госпитальных штаммов Метод позволяет проводить индикацию госпитальных штаммов на второй день микробиологического исследования сразу после оценки роста на желточно-солевом агаре. Другие вышеперечисленные методы (определение антибиотикочувствительности, фаготипирование) требуют для постановки нескольких дней. Кроме того, они проводятся обычно после выделения чистой культуры стафилококка. Отсюда предлагаемый способ ускоряет обнаружение госпитальных эковаров . на 1-3 суток. 3 4964 1 Источники информации 1. Акатов А.К., Зуева А.С. Стафилококки. - М. - 1983. 2. Инструкция по применению гиалуронидазы стрептококковой сухой от 11 августа 1986. (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). 3. Никитин В.М. Справочник экспресс-методов биохимической индикации микробов.- Кишинев, 1986. - С. 146 - 154. 4. Приказ 535 от 22 апреля 1985. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. - М., 1985. 5. Цончев В.Т., Попов Н., Коларов С., Каракашов А. Лабораторная диагностика ревматических заболеваний. - София, 1964. 6.Т.,. // - 1962. .4 - .330 - 334. 7.- 8. , . 23-26 , 1996. - , 1996.-. 216. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4