Концентрат для получения средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЦЕНТРАТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ВИТАЛЬНОЙ МАРКИРОВКИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК(71) Заявители Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(72) Авторы Дражина Наталия Петровна Петрова Елена Александровна Семенова Екатерина Михайловна Воробьева Светлана Александровна Лесникович Анатолий Иванович(73) Патентообладатели Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(57) Концентрат для получения средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток, включающий магнитные наночастицы, олеиновую кислоту и воду, отличающийся тем, что дополнительно содержит триэтаноламин, а в качестве магнитных наночастиц - маггемит при следующем соотношении компонентов, мас.маггемит 8-14 олеиновая кислота 3-6 триэтаноламин 4-17 вода остальное. Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к клеточным технологиям, и может быть использовано для прижизненной маркировки мезенхимальных стволовых клеток магнитными наночастицами с последующей их трансплантацией, манипулированием с помощью внешнего магнитного поля и визуализацией методом магнитнорезонансной томографии. Известно, что для витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток можно применять наночастицы оксидов железа, стабилизированные декстраном 1. В процессе маркировки мезенхимальные стволовые клетки инкубируются с магнитными наночастицами в культуральной среде в течение 2-3 дней. 17804 1 2013.12.30 Существенными недостатками такого средства маркировки являются большие сроки культивирования, низкая эффективность проникновения наночастиц в клетки, необходимость дополнительного использования транспортных агентов, например протамин сульфата, а также отрицательное влияние на дифференцирующую способность стволовых клеток. Известно, что для маркировки стволовых клеток используют наночастицы магнетита,стабилизированные сополимером молочной и яблочной кислот и функционализированные изотиоцианатом флуоресцеина 2. Недостатками данного средства являются использование дорогостоящих материалов и трудоемкость получения композиционных наночастиц с флуоресцентной меткой, а также ограничения по визуализации флуоресценции в глубоких тканях. Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является выбранный в качестве прототипа концентрат для получения средства маркировки стволовых клеток 3,представляющий собой наночастицы магнетита, стабилизированные олеиновой кислотой. Для маркировки клетки инкубируют с магнитными наночастицами с концентрацией 0,05 мг/мл в культуральной среде в течение 48 ч. Данный концентрат для получения средства маркировки стволовых клеток характеризуется цитотоксичностью при инкубации с клетками магнитных наночастиц в концентрации выше 0,1 мг/мл, большим сроком культивирования (48 ч), а также требует значительных трудовых и финансовых затрат. Задачей изобретения является создание такого средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток, которое характеризовалось бы низкой цитотоксичностью и малым сроком культивирования при достаточно простом способе получения. Поставленная задача решается предлагаемым концентратом для получения средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток, включающим магнитные наночастицы, олеиновую кислоту и воду, отличающимся тем, что он дополнительно содержит триэтаноламин, а магнитные наночастицы состоят из маггемита, при следующем соотношении компонентов, масс.наночастицы маггемита 8-14 олеиновая кислота 3-6 триэтаноламин 4-17 вода остальное. Предлагаемый концентрат для получения средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток получают путем щелочного гидролиза солей двух- и трехвалентного железа. Для этого к 25 -ому раствору аммиака при непрерывном перемешивании приливают раствор сульфата железаи хлорида железа . Образовавшийся черный осадок промывают дистиллированной водой методом декантации до 8-9. Для стабилизации полученных магнитных наночастиц смесь олеиновой кислоты и триэтаноламина по каплям добавляют к нагретому на водяной бане до температуры 50-60 С осадку в воде, оставшейся после последней декантации. Нагрев и перемешивание продолжают в течение 2-х ч. Спустя сутки коллоидный раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость переносили в емкость из темного стекла. Оптимальное соотношение компонентов концентрата магнитных наночастиц устанавливается экспериментально. Результаты испытаний предлагаемого концентрата для получения средства витальной маркировки мезенхимальных стволовых клеток представлены в таблице. Концентраты магнитных наночастиц (образцы 2-5 таблицы) - жидкости черного цвета с зеркальным блеском поверхности, которые характеризуются высокой седиментационной стабильностью при хранении, устойчивы при разбавлении и легко управляются магнитным полем. Образцы концентратов 1 и 6 представляют собой суспензии, склонные к разделению фаз при старении. Использование таких суспензий для маркировки мезенхимальных 2 17804 1 2013.12.30 стволовых клеток нецелесообразно, так как вызывает увеличение срока культивирования при маркировке. Наночастицы Олеиновая Триэтанолмаггемита,кислота,амин,1 5,0 10,0 3,0 2 8,0 3,0 4,0 3 12,0 5,0 8,0 4 13,7 5,3 8,1 5 14,0 6,0 17,0 6 18,0 8,0 18,0- истинный коллоидный раствор,- - седиментационно неустойчивая суспензия. Для маркировки мезенхимальных стволовых клеток использовали образец концентрата магнитных наночастиц 4. В целях стерилизации, т.е. очистки от микроорганизмов,концентрат перед применением пропускали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Затем 50 мкл концентрата тщательно смешивали с 1 мл фосфатно-солевого буфера, что соответствовало разведению в 20 раз. Для экспериментов использовали культуры мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга и жировой ткани крысы. Маркировку клеток проводили на пластике. Для этого суспензию клеток сеяли в концентрации 1105 клеток в 4 мл полной культуральной среды на пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм или 1104 клеток в 1 мл полной культуральной среды в лунки 24-луночного культурального планшета. Клетки растили до монослоя, а потом окрашивали. Затем питательную среду удаляли полностью,дважды промывали чашки фосфатно-солевым буфером и заливали 4 мл полной культуральной среды, после чего вносили 80 мкл суспензии магнитных наночастиц. Конечная концентрация магнитных наночастиц в культуральной среде составляла 0,263 мг/мл. Для определения срока культивирования чашки помещали в инкубатор (37 С, 52, 95 -ая влажность) на 12, 24, 36 и 48 ч. За сутки достигается максимальное насыщение клеток магнитными наночастицами и дальнейшее увеличение срока культивирования нецелесообразно, т.е. оптимальное время культивирования при использовании заявляемого концентрата составляет 24 ч, что в 2 раза меньше, чем для прототипа. Оценку жизнеспособности полученных культур проводили методом исключения трипанового синего. Клеточную суспензию смешивали с раствором трипанового синего в соотношении 11, вносили в камеру Горяева и проводили микроскопический учет окрашенных (мертвых) и неокрашенных (живых) клеток во всей камере. Жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток после проведения маркировки магнитными наночастицами в концентрации 0,263 мг/мл составляет не менее 90 . Таким образом, заявляемый концентрат для получения средства маркировки не цитотоксичен при введении магнитных наночастиц в концентрации 0,263 мг/мл, т.е. в 2,63 раз менее цитотоксичен, чем прототип. Для подтверждения факта маркирования мезенхимальных стволовых клеток магнитными наночастицами железо, содержащееся в последних, выявляли в виде берлинской лазури (голубовато-зеленого гексацианоферратажелеза (, которая образуется при действии на них гексацианоферратакалия в кислой среде. Предварительно промытые фосфатно-солевым буфером маркированные клетки фиксировали на пластике 10 -ым раствором формалина в воде в течение 15 мин. Препарат дважды отмывали от формалина дистиллированной водой. Смешивали в соотношении 11 5 -ым водный раствор соляной кислоты и 5 -ый водный раствор гексацианоферратакалия, полученную смесь вносили в лунки и инкубировали в течение 20 мин при 20 С. После чего планшет дважды промывали дистиллированной водой. 3 17804 1 2013.12.30 Мезенхимальные стволовые клетки до маркировки магнитными наночастицами при обработке кислым раствором гексацианоферратакалия не окрашиваются (фиг. 1). На фиг. 2 видно, в маркированных мезенхимальных стволовых клетках железосодержащие наночастицы, окрашенные берлинской лазурью, образуют скопления в цитоплазме, не проникая в ядра. На эффективное витальное маркирование мезенхимальных стволовых клеток указывают следующие результаты исследований магнитные наночастицы сохраняются в клетках при пересеве, включающем отмывку клеток фосфатно-солевым буфером, маркированные клетки не утрачивают способность к адгезии и распластыванию, а также проявляют митотическую активность, причем при делении магнитные наночастицы распределяются между дочерними клетками вместе с цитоплазмой. Использование концентратов с другим соотношением компонентов, приведенных в таблице, для маркирования мезенхимальных стволовых клеток приводит к получению аналогичных результатов. На основании изложенного заявляемый концентрат позволяет прижизненно маркировать мезенхимальные стволовые клетки магнитными наночастицами и характеризуется более низкой цитотоксичностью и малым сроком культивирования, что позволит использовать его более эффективно. Источники информации 1..,.//. - 2007. - . 161. - . 367-383. 2..,.-.,.-.,.,.-./(- ,- )// . - 2010. -. 31. - . 13. - . 3502-3511. 3..,,.,.,.,.,.//. - 2009. . 19. - . 8. - . 1158-1166. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4