Способ определения направления мутационного давления в гене бактерии

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАПРАВЛЕНИЯ МУТАЦИОННОГО ДАВЛЕНИЯ В ГЕНЕ БАКТЕРИИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Хрусталев Владислав Викторович Барковский Евгений Викторович Колодкина Валентина Леонидовна Титов Леонид Петрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Способ определения направления мутационного давления в гене бактерии, заключающийся в том, что выделяют нуклеотидные последовательности исследуемого гена из разных штаммов бактерии, проводят их амплификацию, секвенируют полученные нуклеотидные последовательности, рассчитывают в каждой из них процентное содержание 4,4, 4 и 4 нуклеотидов, соответственно , ,ив четырехкратно вырожденных сайтах, процентное содержание 2, 2, 2 и 2 нуклеотидов, соответственно , ,ив двукратно вырожденных сайтах, расположенных в третьих положениях кодонов, а также отношения 22,222 и 2 222/22 и определяют, что мутационное давление в исследуемом гене бактерии направлено на увеличение частоты трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4, 4 С и 4, или трансверсийилина , если 4 С достоверно выше 4, 4 и 4, или трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4 С, 4 и 4, или трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4, 4 и 4, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно выше 2/, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно выше 2/, или 17349 1 2013.08.30 транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно ниже 2/, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно ниже 2/. Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии и молекулярной биологии, может быть использовано для определения основных механизмов мутагенеза в генах патогенных бактерий с целью последующего использования этих данных для выделения наиболее устойчивых участков бактериальных белков, в том числе для отбора наиболее устойчивых эпитопов. Известен способ определения точечных нуклеотидных заменв ДНК 1. С помощью данного способа можно определить наличие определенного числа нуклеотидных мутаций во фрагменте изучаемого гена, предположить их направление и механизм. Способ основан на амплификации фрагмента гена с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР) с последующей гибридизацией амплифицированной ДНК на биочипе, содержащем определенный набор олигонуклеотидов, с которыми может происходить комплементарное связывание образца (связывание распознается по изменению флуоресценции). Основным недостатком данного способа является то, что набор нуклеотидных мутаций, которые он позволяет выявить, ограничен. Перед применением данного метода и его аналогов необходимо изготовить набор олигонуклеотидов для идентификации определенных нуклеотидных замен. Судить о направлении и механизме мутации можно путем сопоставления собственных данных с последовательностью гена, принятой за исходную, что не всегда соответствует действительности. Количество мутаций, выявляемых в генах бактерий, как правило, невелико. Судить о направлении мутационного давления на основании анализа нескольких мутаций представляется некорректным. Наиболее близким способом, принятым за прототип, является способ выявления мутаций при помощи гибридизации на олигонуклеотидных микроматрицах 2. Сущность способа заключается в том, что производят выделение нуклеотидных последовательностей исследуемого гена из образцов клинического материала, который подвергается амплификации при помощи ПЦР, а затем происходит фрагментация (случайным образом ДНК нарезается на участки одинаковой длины). После этого полученный набор участков ДНК связывается с мечеными флуоресцентными зондами олигонуклеотидными последовательностями, закрепленными на специальной микроматрице. На матрице должны присутствовать все возможные комбинации из восьми нуклеотидов (всего 65536 олигонуклеотидов). Комплементарное связывание одного из участков изучаемого гена с каким-либо олигонуклеотидом распознается по изменению флюоресценции. Получение данных о мутагенезе исследуемого микроорганизма производят путем сравнения с последовательностью гена,принятой за исходную. Известный способ имеет ряд недостатков. Чем длиннее анализируемый участок гена,тем ниже процент выявления мутаций в нем данным методом (для последовательности длиной 5400 нуклеотидов - только 74 ). На качестве анализа также отрицательно сказывается наличие прямых и инвертированных повторяющихся последовательностей в изучаемом фрагменте ДНК или РНК (образуются вторичные структуры, препятствующие связыванию с олигонуклеотидами). Всех этих недостатков можно избежать при использовании прямого секвенирования для последующего анализа механизмов и направлений мутаций в генах бактерий. Кроме того, для анализа путем гибридизации на олигонуклеотидной микроматрице какой-либо вариант бактериального гена необходимо принимать за исходный, чтобы по отношению к нему определять направление мутации. В предложенном нами способе этот недостаток устраняется путем анализа значений оригинальных показателей, позволяющих определить преимущественное направление 2 17349 1 2013.08.30 нуклеотидных замен. Данные показатели отражают частоты использования нуклеотидов,достигшие определенного уровня (в четырехкратно и двукратно вырожденных сайтах) в течение долгого процесса мутагенеза. Задачей заявляемого способа является увеличение точности определения основных направлений мутационного давления в генах бактерий, а следовательно, определения биохимических механизмов, вызывающих мутационное давление. Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа определения направления мутационного давления в гене бактерии, заключающегося в том, что выделяют нуклеотидные последовательности исследуемого гена из разных штаммов бактерии,проводят их амплификацию, секвенируют полученные нуклеотидные последовательности,рассчитывают в каждой из них процентное содержание 4, 4, 4 и 4 нуклеотидов,соответственно , ,ив четырекратно вырожденных сайтах, процентное содержание 2, 2, 2 и 2 нуклеотидов, соответственно , ,ив двукратно вырожденных сайтах, расположенных в третьих положениях кодонов, а также отношения 22,222 и 2 222/22 и определяют, что мутационное давление в исследуемом гене бактерии направлено на увеличение частоты трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4, 4 и 4, или трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4, 4 и 4, или трансверсийилина , если 4 достоверно выше 4, 4 и 4, или трансверсийилина , если Р 4 Т достоверно выше 4, 4 и 4, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно выше 2/, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно выше 2/, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно ниже 2/, или транзицийна , если 2 достоверно выше 2 и 2 достоверно ниже 2/. Пример. Определение направления и механизмов мутационного давления в гене. Были просеквенированы 16 нуклеотидных последовательностей кодирующего участка генадлиной 681 нуклеотид. Последовательности были получены амплификацией в ПЦР фрагмента гена регулярного -белка с использованием праймеров 1 и 1 . ДНК клинических изолятовв объеме 2 мкл добавляли к 48 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл 10 ПЦР буфера (100 мМ -8,4, 500 мМ , 6 мкл 25 мМ 2, 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (10 мМ каждый), 2,5 ед.ДНК полимеразы (-) и 1 мкл (25 ) каждого праймера. Стерильную - воду добавляли до объема 50 мкл. В ДНК-амплификаторе проводили 35 автоматических циклов 30 сек. денатурация при 95 С, 30 сек - отжиг при 55 С, 1 мин - элонгация при 72 С. В последнем цикле амплификации элонгация продолжалась 10 мин при 72 С. Ампликоны элюировали из геля и очищали, используя коммерческий наборпроизводства. Каждый очищенный ампликон растворяли в 40 мкл деионизированной воды и 5 или 7 мкл использовали в сиквенс-реакции с 5(). Сиквенс нуклеиновых кислот выполняли на обеих цепях ДНК, используя праймеры, которые применялись в ПЦР. 3 17349 1 2013.08.30 Расчеты, произведенные по формуле 1, показали, что четырехкратно вырожденные сайты нуклеотидных последовательностей генаобогащены цитозином (уровень 4 варьировался от 38,8 до 36,5 ), уровень гуанина в них является наиболее низким(4 варьировался от 9,4 до 8,6 ), в то время как уровень аденина (4) варьировался от 21,6 до 20,9 , уровень тимина (4) варьировался от 33,9 до 31,0 . Например, для определения 4 в одной из нуклеотидных последовательностей ,был произведен следующий расчет по формуле 1 434 410010033,9. 431137254444 Частоты использования нуклеотидов в двукратно вырожденных сайтах, рассчитанные по формуле 2, варьировали в следующих пределах 2 - от 23,9 до 20,52 - от 18,2 до 17,02 - от 34,1 до 33,02 - от 28,4 до 25,0 . Согласно результатам применения метода парных разностей 2 достоверно превышает 2, а 2 достоверно превышает 2. Значение показателя 2, вычисленное по формуле 3, варьировалось среди 16 последовательностей от 1,4 до 1,2. Значение показателя 2, вычисленное по формуле 4, варьировалось среди 16 последовательностей от 0,8 до 0,7. Значение показателя 2/, вычисленное по формуле 5, было постоянным (0,98) среди 16 последовательностей. Показатель 2 статистически достоверно превышает показатель 2/. Показатель 2 имеет более низкие значения, чем показатель 2/. Мутационное давление в генеможно охарактеризовать следующим образом. Наиболее частым направлением трансверсий следует признатьнаина . Транзициинапроисходят чаще, чем транзициина , при этом их частоты существенно превышают частоты возникновения транзицийнаинасоответственно. Однако транзициинапроисходят значительно чаще, чем транзициина . Эти данные позволяют предположить, что наиболее устойчивыми участками в белкеявляются те, которые кодируются фрагментами ДНК с наименьшим относительным содержанием гуанина. Предложенный способ позволяет повысить точность определения направления мутационного давления в бактериальных генах, причем отдельно для трасверсий и для транзиций сведения, полученные данным способом, могут быть использованы для борьбы с бактериальными заболеваниями путем повышения эффективности отбора наименее подверженных мутациям эпитопов для создания вакцин и иммунологических диагностических наборов. Источники информации 1. Заявка США на патент на изобретение 20080448208 20080205, МПК 12 1/68,2010. 2. Патент на изобретение 20090559252 20090914, МПК 12 1/68, 2010. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4