Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ АГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Шамова Екатерина Вячеславовна Горудко Ирина Владимировна Черенкевич Сергей Николаевич Тимошенко Александр Викентьевич(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов, заключающийся в том, что осуществляют забор крови у пациента, получают обогащенную тромбоцитами плазму и дважды отмывают тромбоциты от плазмы центрифугированием, затем тромбоциты суспензируют в фосфатно-солевом буфере и, регистрируя кинетическую кривую светопропускания полученной суспензии, индуцируют сначала агрегацию тромбоцитов добавлением лектина зародышей пшеницы, а затем, после выхода кривой светопропускания на плато, дезагрегацию тромбоцитов добавлением -ацетилглюкозамина, после чего по кривой светопропускания определяют максимальную величину светопропускания 0, минимальную величину светопропускания , рассчитывают параметр стабильности агрегатовпо формуле(/0)100 и оценивают агрегационную активность тромбоцитов по значению 0 и . Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов с целью выявления нарушений в функциональной активности тромбоцитов и индивидуальной чувствительности к антиагрегационным препаратам. Известен способ исследования агрегации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом 1, где агрегацию тромбоцитов инициировали одновременным добавлением нескольких индукторов агрегации (аденозин дифосфат(АДФ), адреналин, коллаген) к обогащенной тромбоцитами плазме на предметном стекле. Недостатком данного способа является визуальный метод оценки тромбоцитарных агрегатов. Кроме того, причиной ошибок может быть неравномерное помешивание стеклянной палочкой суспензии тромбоцитов, а также позднее смешивание индукторов агрегации с тромбоцитами, которые при попадании на стекло начнут сразу же адгезировать к нему,запуская при этом процессы активации. 16748 1 2013.02.28 Наиболее близким к предлагаемому способу является способ исследования антиагрегационного действия препаратов с помощью определения агрегации тромбоцитов 2, включающий забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, введение антиагрегационного препарата с последующим перемешиванием, инкубацией плазмы с препаратом и без него при 36,5-37,5 С и введением индуктора агрегации АДФ. Процесс агрегации регистрируют по изменению светопропускания суспензии тромбоцитов. Об эффективности препарата судят по его способности снижать степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Недостатком данного способа является использование в качестве индуктора агрегации только одного агониста АДФ, активирующего тромбоциты через пуринорецепторы 212, 21, 21. Общим недостатком для двух способов является также то, что агрегация тромбоцитов исследуется в плазме крови, содержащей определенный антикоагулянт, следовательно,необходимо учитывать его влияние на агрегационную активность тромбоцитов, что особенно важно в случае антикоагулянтов, связывающих свободные ионы кальция в среде. Кроме того, так как в плазме крови содержатся белки, утилизирующие глутатион, то с течением времени происходит снижение его концентрации и окисление (обзор по методам определения глутатиона), что также может влиять на агрегационную активность тромбоцитов 3. Изолирование тромбоцитов от компонентов плазмы, а также анализ агрегации тромбоцитов, активированных по различным сигнальным путям позволит исключить влияние плазменных факторов на агрегацию и получить адекватную информацию о функциональном состоянии клеток и антиагрегационной активности различных препаратов. Задачей изобретения является повышение чувствительности способа оценки агрегационной активности тромбоцитов за счет использования индуктора агрегации, активирующего клетки по различным сигнальным путям, и устранения внешних факторов,влияющих на агрегационную активность тромбоцитов. Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки агрегационной активности тромбоцитов, включающем забор крови у пациента, получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) и двукратную отмывку тромбоцитов от плазмы центрифугированием, затем тромбоциты суспензируют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и, регистрируя кинетическую кривую светопропускания полученной суспензии, индуцируют сначала агрегацию тромбоцитов добавлением лектина зародышей пшеницы ( , ), а затем, после выхода кривой светопропускания на плато, дезагрегацию тромбоцитов добавлением-ацетилглюкозамина, после чего по кривой светопропускания определяют максимальную величину светопропускания 0, минимальную величину светопропускания , рассчитывают параметр стабильности агрегатовпо формуле(/0)100 и судят об агрегационной активности тромбоцитов по степени агрегации 0 и значению параметра . Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Забор крови осуществляют утром натощак из локтевой вены, стабилизируют 3,8 цитрата натрия в соотношении 19, центрифугируют при 200 в течение 10 мин, аккуратно снимают верхний слой - ОТП. Изолированные от компонентов плазмы тромбоциты получают двукратным центрифугированием ОТП при 600 в течение 3 мин с последующим отмыванием осадка клеток Трис-буфером (13,3 мМ , 120 мМ , 15,4 мМ , 6 мМ -глюкоза,1,5 мМ ЭДТА,6,9) и сохраняют при комнатной температуре в концентрации 2501010 кл/л. Перед измерением изолированные тромбоциты доводят до концентрации 250109 кл/л ФСБ с 2 (137 мМ , 2,7 мМ , 10 мМ 24/24, 1 мМ 2,0,5 мМ 2,7,35), помещают в кювету прибора при 37 С с постоянным перемешиванием и добавляют лектин(7 мкг/мл). Агрегацию регистрируют по изменению уровня светопропускания суспензии тромбоцитов. После выхода агрегационной кривой на плато добавляют гаптенный углевод -ацетилглюкозамин (, 100 мМ). Об агрегационной 2 16748 1 2013.02.28 активности тромбоцитов судят по степени -индуцированной агрегации Т 0 и по параметру стабильности агрегатов , который рассчитывают по формуле(/0)100 , гдевеличина светопропускания суспензии клеток после добавления , а 0 максимальное изменение величины светопропускания суспензии клеток в процессе агрегации (степень агрегации). Так как рецепторные белки на поверхности тромбоцитов являются гликозилированными, то использование лектинов в качестве индукторов агрегации позволяет одновременно активировать несколько рецепторов на поверхности тромбоцитов и запускать процессы агрегации по различным сигнальным путям. Добавление гаптенного ингибитора к лектинагрегированным тромбоцитам разрушает связь лектин - гликозилированный рецептор и инициирует дезагрегацию, что позволяет оценивать стабильность образованных агрегатов. Важной модификацией способа является удаление компонентов плазмы за счет двукратного отмывания, что исключает их возможное влияние на результаты анализа. Кроме того, способ позволяет варьировать состав среды и проводить исследования при значениях концентрации ионов кальция, близких к физиологическим (1 мМ). Предлагаемое изобретение поясняется фиг. 1-2. На фиг. 1 представлены типичные кинетические кривые -индуцированной агрегации (кривая 1) и -индуцированной дезагрегации тромбоцитов (кривая 2). На фиг. 2 представлены данные по действию различных ингибиторов на параметры агрегации тромбоцитов (0, ). Сущность изобретения поясняется примерами. Пример 1. Исследовали агрегационную активность тромбоцитов у 24 больных с острым коронарным синдромом (ОКС) и 12 здоровых доноров. Оценивали степень тромбин- и индуцированной агрегации отмытых тромбоцитов, а также параметр стабильности агрегированных тромбоцитов. При исследовании агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином, не выявлено различий между группами здоровых доноров и больных с ОКС. Степень -индуцированной агрегации также не отличалась в двух группах, в то время как стабильность -индуцированных агрегатов у больных с ОКС достоверно ниже, чем у контрольной группы (данные представлены в таблице). Параметры агрегационной активности тромбин- и -активированных тромбоцитов крови доноров и больных с ОКС Контроль ОКС Параметр,88,211,5 76,716,9 Р 0,02. Полученные данные свидетельствуют о том, что анализ -индуцированной агрегации, описанный в предлагаемом способе, позволяет выявить нарушения агрегационной активности тромбоцитов при сердечно-сосудистой патологии. Пример 2. Заявляемый способ позволяет оценивать действие различных ингибиторов (потенциальных антиагрегационных препаратов) на агрегационную активность тромбоцитов. Исследовано действие гепарина (геп), диэтил-малеата (24 мМ, ), менадиона (50 мкМ,мен), -этилмалеимида (50 мкМ, ), нитропруссида натрия (0,5 мМ, НП), -аргинина(2 мМ, -г) на степень и стабильность -индуцированных агрегатов. Ингибиторы инкубировали в течение 2 мин при 37 С и постоянном перемешивании с отмытыми тромбоцитами, помещенными в ФСБ, и затем вводили .добавляли после выхода агрегационной кривой на плато. На фиг. 2 приведены данные по влиянию ингибиторов на степень (0) и стабильность-агрегированных тромбоцитов. Получено, что дан 3 16748 1 2013.02.28 ные препараты снижают как степень, так и стабильность тромбоцитарных агрегатов, что свидетельствуют о подавлении процессов внутриклеточной сигнализации в присутствии исследуемых соединений. Анализ данных, приведенных на фиг. 2, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ может быть использован для оценки антиагрегационной активности препаратов. Таким образом, заявляемый способ в сравнении с прототипом позволяет повысить чувствительность оценки агрегационной активности тромбоцитов за счет использования индуктора агрегации, активирующего клетки по различным сигнальным путям, и устранения внешних факторов, влияющих на агрегационную активность тромбоцитов. Источники информации 1.2250461,01 33/48,01 33/49,01 33/86, 2005. 2.2188419,01 33/15,01 33/86, 2002. 3.,.// . - 2003. . 42. - . 129-136. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4