Способ оценки иммуномодулирующей активности химических и физических средств

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ СРЕДСТВ(71) Заявитель Витебский государственный медицинский институт(73) Патентообладатель Витебский государственный медицинский институт(57) Изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунофармакологии, и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине для поиска иммуноактивных агентов и подбора средств для иммуномодулирующей терапии. Предлагаемый способ существенно повышает чувствительность, информативность и точность определения иммуноактивных свойств препаратов. Отличительным признаком предлагаемого способа является обработка тестируемым средством не всей суспензии лейкоцитов, а 1/5 части, с последующим удалением иммуномодулятора и оценкой его отсроченного эффекта на иммунологические параметры в условиях сокультивирования обработанных иммуномодулятором и интактных клеток по сравнению с клетками, культивированными в среде. Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунофармакологии, и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине для поиска иммуноактивных средств и подбора иммуномодулирующей терапии. Известны способы тестирования иммуномодулирующей активности химических и фармакотерапевтических средств, использующие в качестве тест-системы культуру лимфоцитов или лейкоцитов крови, которые обрабатывают тестируемым препаратом определенный промежуток времени и оценивают их непосредственную реакцию на испытуемое средство 1, 2. В зависимости от направления обнаруживаемого эффекта препарат квалифицируется как иммуностимулятор или иммунодепрессант. Недостатком использования такой модельной системы является ее значительная условность. Во-первых, такой способ позволяет определять лишь эффект препарата на отдельное звено иммунологической реактивности, но не учитывает сложную систему межклеточных взаимодействий, а следовательно не позволяет судить о конечном эффекте препарата. В итоге эффектне совпадает с таковым, а применение выбранного препарата может усилить дисбаланс иммунной системы. Во-вторых, в данной модели не учитывается, что препарат может не оказывать непосредственного немедленного эффекта,но выступать индуктором синтеза цитокинов (или их антагонистов), приводя к определенным изменениям всей популяции клеток. Предполагаемое изобретение устраняет вышеуказанные недостатки, существенно повышает чувствительность, информативность и точность определения иммуноактивных свойств препаратов. Предлагаемый способ оценки иммуномодулирующей активности предусматривает, что обработке иммуномодулятором подвергается не вся клеточная культура, а лишь 1/5 часть ее (так называемые модифицированные клетки), а затем, после удаления иммуномодулятора, производится совместное культивирование модифицированных и интактных лимфоцитов в аутологичной смешанной культуре. После инкубации не менее 2 ч сравнивают выбранные (любые) параметры клеток в опытной культуре по сравнению с контрольной(инкубация клеток в среде), и по их изменению судят об эффекте иммуномодулятора. 4621 1 Обоснованием использования подобной клеточной модельной системы является гипотеза, смысл которой состоит в том, что для оптимального проявления эффекта препаратов в культуре обязательно должны присутствовать как регулирующие (модифицированные), так и отвечающие клетки. Установлены факты, что иммуномодулирующие фармакотерапевтические (преднизолон, пирогенал, эуфиллин, тималин и др.) и физические (низкоинтенсивный гелий-неоновый лазер, волны миллиметрового диапазона) средства часто не оказывали эффекта в клеточной системе при сравнении опыта (обработанные клетки) с контролем (необработанные). В то же время, при использовании в качестве опытной - смеси обработанных и необработанных клеток, а в контроле - необработанных клеток, проявлялся выраженный эффект. Способ осуществляется следующим образом. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из гепаринизированной венозной крови (10 ЕД гепарина на 1 мл крови) на градиенте плотности фиколла- верографина или используют смесь лейкоцитов,полученную из крови путем отстаивания. Клетки отмывают от плазмы трижды питательной средой. Готовую клеточную суспензию разводят до плотности клеток 2,5106/мл. Исследуемые препараты растворяют накануне в изотоническом растворе хлористого натрия. Готовят несколько разведений препаратов в рабочих концентрациях, которые подбирают предварительно в реакции лейколизиса на клетках здоровых лиц. В качестве рабочей концентрации используют наименьшее разведение препарата, не оказывающее повреждающего действия на клетки (жизнеспособность не менее 95 ). На 1 этапе производят обработку клеток иммуномодуляторами, для чего смешивают в лунках планшет для иммунологических реакций 0,2 мл суспензии лимфоцитов с 0,2 мл тестируемого препарата в рабочей концентрации (или с 0,1 мл культуральной среды контроль). Смесь инкубируют в термостате при 37 С в течение 30 мин. После инкубации клетки отмывают трижды средой. Осадок клеток разводят в свежей питательной среде до первоначального объема (0,2 мл). Наэтапе приготавливают аутологичную смешанную культуру из обработанных иммуномодулятором (модифицированных) и необработанных (интактных) клеток. Для этого в отдельной пробирке смешивают в опыте- 0,1 мл преинкубированных с иммуномодулятором лимфоцитов с 0,4 мл свежих аутоклеток в контроле - 0,1 мл лимфоцитов, преинкубированных в среде, с 0,4 мл свежих лимфоцитов. Полученную культуру клеток инкубируют не менее 2 ч при 37 С, а затем используют в иммунологических реакциях, определяя изменение экспрессии рецепторов, пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митогены (удлиняя срок инкубации до 3 суток) или синтез цитокинов в опытной культуре по сравнению с контрольной. При этом принцип оценки иммуномодуляторных свойств может быть любым - по изменению экспрессии рецепторов клеток, их функциональных свойств, синтеза цитокинов и т.д. Основным условием и отличительным признаком предлагаемого метода является оценка отсроченного эффекта тестируемых иммуномодулирующих агентов в условиях взаимодействия (сокультивирования) обработанных иммуномодулятором и интактных клеток по сравнению с клетками, культивированными в среде. Пример 1. Оценка иммуномодуляторного эффекта гелий-неонового лазера и фармакотерапевтических средств по изменению экспрессии рецепторов лимфоцитов. У 3 здоровых лиц брали 7-10 мл крови с гепарином (10 ЕД/мл), выделяли из нее мононуклеары по стандартной методике на фиколл-верографине. Клетки отмывали от плазмы в среде 199 и разводили до рабочей концентрации 2,5109/л. Для получения модифицированных клеток часть свежевыделенных лимфоцитов обрабатывали иммуномодуляторами в рабочих концентрациях или подвергали воздействию лазерного облучения (аппарат ЛГН-111, мощность излучения на конце световода 2,6 мВт/см 2) в течение 30 мин в бессывороточной среде (контроль - инкубация в среде в аналогичных условиях), а затем трижды отмывали средой 199 и разводили до первоначального объема. Прекультивированные клетки смешивали в соотношении 14 с необработанными (интактными) аутологичными клетками. Культуру инкубировали 2 ча при 37 С. Сравнивали экспрессию рецепторов к эритроцитам барана и - антигенов в смешанной культуре модифицированных и интактных клеток по сравнению с контрольными сокультивированными клетками (инкубация в среде). Экспрессию рецепторов к эритроцитам барана определяли в реакции розеткообразования общепринятым способом, а экспрессию - антигенов оценивали в реакции непрямой иммунофлуоресценции с моноклональными антителами серии ИКО-1. Все варианты опытов ставили в 3 повторностях. Данные по 3 параллелям усредняли. Достоверность различий оценивали по критериюСтьюдента. Полученные данные приведены в табл. 1, где также представлены результаты, полученные при использовании известной модельной системы. 4621 1 Таблица 1 Иммуномодулирующий эффект гелий-неонового лазера и фармакотерапевтических средств на экспрессию рецепторов лимфоцитов в различных тест-системах Иммуномодулятор Тималин Примечание- достоверность различий при Р 0,05. Представленные в таблице данные указывают на наличие иммуностимулирующих свойств у тималина,стафилококкового анатоксина и гелий-неонового лазера, причем степень изменения изучаемых показателей в предлагаемой тест-системе значительно выше, чем в известной. Пример 2. Оценка иммуномодулирующих свойств препарата при индивидуальном подборе для проведения иммуномодулирующей терапии у больных гнойной хирургической инфекцией. Получали периферическую кровь больных в количестве 5 мл с гепарином из расчета 10 ЕД/мл крови. Выделяли лейкоциты путем отстаивания крови в термостате в течение 45 мин или чистую популяцию мононуклеаров разделением на градиенте плотности фиколл-верографин. Клетки отмывали от белков плазмы путем центрифугирования в среде 199 при 1000 об/мин в течение 5 мин. Процедуру повторяли трижды. Готовили рабочее разведение клеток 2-2,5109/л в питательной среде. Часть клеток обрабатывали тестируемыми иммуномодуляторами в рабочих концентрациях в течение 30 мин при 37 С, отмывали от препарата, разводили до первоначального объема питательной средой и соединяли в соотношении 14 с необработанными клетками. В контрольных культурах смешивали клетки, преинкубированные в среде с неинкубированными лимфоцитами (т.н. контроль сокультивированных клеток). Смешанную культуру инкубировали в течение 2 ч при 37 С, а затем оценивали изменение экспрессии рецепторов. Вычисляли среднюю из 3 параллельных определений. Вычисляли индекс изменения показателя (ИИП) по формуле усредненный показатель опыта - показатель контроля ИИП 100 усредненный показатель контроля За значимое изменение показателя принимали изменение индекса на 50 в сторону снижения или увеличения. Таблица 2 Оценкаиммуномодулирующих свойств препаратов для индивидуального подбора иммунокорректоров у больных гнойной инфекцией Больные К. Изменение параметров лимфоцитов экспрессия Е-РОК экспрессия стимуляция 84 стимуляция 54 стимуляция 28 стимуляция 30 стимуляция 32 стимуляция 25 стимуляция 12 стимуляция 5 стимуляция 56 стимуляция 59 стимуляция 60 стимуляция 40 Тестируемый иммуномодулятор стафилококковый анатоксин тималин Т-активин стафилококковый анатоксин тималин Т-активин Результаты тестирования показывают выраженный стимулирующий эффект стафилококкового анатоксина у больного К., тималина и Т-активина (но не стафилококкового анатоксина) у больного С. Пробное лечение показало высокую эффективность терапии выбранным иммуномодулятором. Из представленных данных видно, что оценка иммуноактивных свойств иммуномодулятора в предлагаемой нами модельной системе позволяет произвести максимально эффективный и точный подбор регуляторов иммунитета, оценивая изменение любых клеточных параметров. 4621 1 Источники информации 1. А.с. СССР 1704084, МПК 01 33/53, 1989. 2. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств. - М., 1984. Способ оценки иммуномодулирующей активности химических и физических средств путем определения эффекта их воздействияна лейкоциты крови, отличающийся тем, что предварительно обрабатывают тестируемым средством часть суспензии лейкоцитов в течение 30 мин при температуре 37 С, затем отмывают их физиологическим раствором и смешивают в соотношении 14 с аутологичными необработанными клетками, инкубируют полученную смешанную культуру не менее 2 ч при температуре 37 С и оценивают изменение иммунологических параметров клеток в аутологичной смешанной культуре, содержащей обработанные указанным средством и необработанные клетки, по сравнению с иммунологическими параметрами клеток, культивированных в среде. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 4