Способ оценки антигрибковой активности растительного экстракта

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Филонов Валерий Петрович Колядич Елена Сергеевна Мельникова Людмила Александровна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56) ДУДЧИК Н.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Международной конференции. Минск, 2004. - С. 199-201.2240556 2, 2004.26942 , 2007. БАРОНЕЦ Н.Г. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. -5. - С. 71-73.2189040 2, 2002.2289132 1, 2006.(57) Способ оценки антигрибковой активности растительного экстракта, заключающийся в том, что готовят питательную среду с 6,6-7,0, содержащую 2,0 г пептона, 1,0 г глюкозы, 3,0 г мальтозы и воду дистиллированную до 100 мл, которую инокулируют тесткультурой, выбранной из штаммов дрожжеподобных, плесневых или мицелиальных грибов до конечной концентрации 1104-1105 клеток/мл, инокулят разливают в измерительные ячейки микробиологического анализатора, в часть ячеек вносят растительный экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях, тест-культуру культивируют при температуре 22-28 С с одновременной параллельной импедиметрической регистрацией показателей для определения времени детекциироста грибковой тест-культуры,при увеличении значенияроста тест-культуры в питательной среде с растительным экстрактом по сравнению сроста тест-культуры в питательной среде без экстракта в 1,5 раза определяют показатель 50, соответствующий концентрации растительного экстракта, при которой ингибируется рост грибковой тест-культуры на 50 , и при значении 50,находящемся в диапазоне от 1 до 20 , антигрибковую активность растительного экстракта оценивают как выраженную, при 50, находящемся в диапазоне от 20 до 50 , как среднюю, а при 50, находящемся в диапазоне от 50 до 100 , - как слабую. Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и фармакологии. Задачей заявленного изобретения является увеличение области применения способа в отношении дрожжеподобных и плесневых грибов, повышение чувствительности способа,сокращение времени тестирования, а также разработка количественных характеристик оценки степени антигрибковой активности. 13119 1 2010.04.30 Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки антигрибковой активности растительного экстракта, заключающийся в том, что готовят питательную среду с 6,6-7,0, содержащую 2,0 г пептона,1,0 г глюкозы, 3,0 г мальтозы и воду дистиллированную до 100 мл, которую инокулируют тест-культурой, выбранной из штаммов дрожжеподобных, плесневых или мицелиальных грибов до конечной концентрации 1104-1105 клеток/мл, инокулят разливают в измерительные ячейки микробиологического анализатора, в часть ячеек вносят растительный экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях, тест-культуру культивируют при температуре 22-28 С с одновременной импедиметрической регистрацией показателей для определения времени детекциироста грибковой тест-культуры, при увеличении значенияроста тест-культуры в питательной среде с растительным экстрактом по сравнению сроста тест-культуры в питательной среде без экстракта в 1,5 раза определяют показатель 50, соответствующий концентрации растительного экстракта,при которой ингибируется рост грибковой тест-культуры на 50 , и при значении 50, находящемся в диапазоне от 1 до 20 , антигрибковую активность растительного экстракта оценивают как выраженную, при 50, находящемся в диапазоне от 20 до 50 , как среднюю, а при 50, находящемся в диапазоне от 50 до 100 , - как слабую. Для оценки степени антигрибковой активности предложен показатель 50 - такая концентрация растительных экстрактов, которая ингибирует рост грибковых тест-культур на 50 . Предложены также количественные параметры показателя 50 для оценки степени(класса) антигрибковой активности растительных экстрактов. Штаммы могут быть получены из государственных музеев и коллекций, а также быть выделены в виде изолятов в ходе микробиологических исследований. Оценка роста тест-культур грибов по изменению электрохимических показателей среды указанного состава позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что осуществляется импедиметрическая регистрация электрохимических изменений питательной среды, а это позволяет провести детекцию роста грибковой тест-культуры в течение 4-10 ч, а также увеличить число грибковых тест-культур при проведении анализа. Пример выполнения. Пример 1. Требуется определить 50 для растительного экстракта 1. В качестве тест-культур используют дрожжеподобный гриб 10231, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ),иизолят 5, полученный в ходе санитарно-гигиенического исследования пищевого производства. Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (51) С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Сабуро. Для приготовления рабочей культуры тест-штамм культивируют в термостате на среде указанного состава, в которую добавляют агар до 2 . Режим культивирования при(222) С дляв течение 48-72 ч. Смывы проводят фосфатным буферным раствором, используя стандарт мутности на 10 единиц мутности. Содержание клеток тестштамма в инокуляте доводят до 106 КОЕ/мл. Подтверждение содержания клеток в рабочей культуре проводят путем высева на среду приведенного состава, в которую добавляют агар до 2 . В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 100,0 мл дистиллированной воды) 1 Пептон 5,0 г 2 Глюкоза 1,0 г 3 Мальтоза 3,0 г 4 Вода дистиллированная 100 мл 6,6-7,0. Стерилизация 121 С в течение 15 мин. 2 13119 1 2010.04.30 Приготовленную среду инокулируют параллельно тест-штаммом 10231 иизолят 5 до конечной концентрации 1104-1105 клеток/мл,разливают в измерительные ячейки анализатора, вносят исследуемый растительный экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях и инкубируют в термоинкубаторе в течение 10-12 ч при (222) С. Получены следующие результаты. Время детекции роста тест-культуры(без исследуемого экстракта) составляет для 10231 - 6,2 часа, дляизолят - 5-5,8 ч. Для экстракта 1 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляет Таблица 110231 изолят 5 Концентрация 5- 6,3 часа Концентрация 5- 5,9 часа Концентрация 10- 6,9 часа Концентрация 10- 6,4 часа Концентрация 20- 7,8 часа Концентрация 20- 7,9 часа Концентрация 40- 9,3 часа. Концентрация 40- 8,7 часа. Таким образом, при внесении в среду экстракта 1 в концентрации 40 время детекции роста тест-культуры 10231 возросло с 6,2 до 9,3 ч, а тесткультурыизолят 5 возросло с 5,8 до 8,7 ч, т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для экстракта 1 составляет 40 для обеих тест-культур. Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 1 проявляет среднюю антигрибковую активность в отношении 10231 иизолят 5, т.к. к 50 ингибированию роста культур привела концентрация 40 . Пример 2. Требуется определить 50 для растительного экстракта 2. В качестве тест-культур используют мицелиальный грибБИМ 19 и дрожжеподобный гриб 10231. Тест-штамм 10231 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов(ВКПМ). Тест-штаммБИМ -19 получен из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научая коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси. Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (51) С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Сабуро. Пробоподготовку и проведение анализа проводят по методике, описанной в п. 1 раздела Примеры выполнения. Получены следующие результаты. Время детекции роста тест-культуры(без исследуемой композиции) составляет дляБИМ -19 - 7,5 ч, для 10231 - 6,2 ч. Для экстракта 2 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляет Таблица 2 БИМ -1910231 Концентрация 15- 7,9 часа Концентрация 15- 6,9 часа Концентрация 30- 10,8 часа Концентрация 30- 7,7 часа Концентрация 60- 11,3 часа Концентрация 60- 9,3 часа Таким образом, при внесении в среду экстракта 2 в указанных концентрациях время детекции роста тест-культурыБИМ -19 возросло с 7,5 до 11,3 ч при внесении концентрации 60 . 3 13119 1 2010.04.30 Время детекции роста тест-культуры 10231 возросло с 6,2 до 9,3 ч для концентрации 60 , т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для экстракта 2 составляет 5060 в отношении двух протестированных грибных штаммов. Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 2 проявляет слабую антигрибковую активность в отношенииБИМ -19 и 10231, т.к. только 60 этой композиции привели к 50 ингибированию роста культур. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в увеличении чувствительности, уменьшении времени тестирования до 2,2-9,0 ч, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также увеличении числа тесткультур при проведении определения показателя антигрибковой активности 50, а также дает возможность оценить степень антигрибковой активности растительных экстрактов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4