Способ оценки NO-продуцирующей активности лейкоцитов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявители Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр радиационной медицины и экологии человека Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(72) Авторы Гомоляко Андрей Викторович Новикова Ирина Александровна Прокопович Александр Семнович(73) Патентообладатели Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(57) Способ оценки -продуцирующей активности лейкоцитов, отличающийся тем, что одну часть лейкоцитов периферической крови культивируют в течение 3 часов в питательной среде со стимулятором продукции , а вторую часть - без указанного стимулятора, затем определяют уровень продукциилейкоцитами, культивируемыми в среде без добавления стимулятора Б, и уровень продукциилейкоцитами, культивируемыми в среде со стимулятором С, после чего рассчитывают функциональный продуцирующий резерв ФР лейкоцитов по формулеФР, Б и при значении ФР более 1 -продуцирующую активность лейкоцитов определяют как неизмененную, а при значении ФР 1 или менее - как сниженную. Изобретение относится к медицине, точнее к клинической лабораторной диагностике,и может быть использовано для оценки функциональной активности лейкоцитов больных хроническими рецидивирующими гнойными инфекциями. Известен способ определения функциональной активности лейкоцитов периферической крови путем культивирования их в питательных средах 15 часов с последующим определением метаболитов оксида азотав инкубационной среде. Суть способа заключается в том, что в кровь, взятую из кубитальной вены в объеме 6 мл в пробирку, содержащую гепарин 20 ед/мл, добавляют равный объем 4 декстрана, смесь отстаивают 40 минут при комнатной температуре, верхний слой с лейкоцитами отбирают и разводят фосфатным буфером с 20 мМ ЭДТА, центрифугируют 10 минут при 200 , после удаления 14883 1 2011.10.30 надосадочной жидкости эритроциты лизируют в 10 мл 0,15 М раствора хлорида аммония 10 минут при 37 С, лейкоциты отмывают фосфатным буфером, суспендируют в концентрации 10106/мл в питательной среде -1640 с 5 эмбриональной телячьей сывороткой и в объеме 0,5 мл клеточную суспензию инкубируют 15 часов при 37 С, после чего в надосадочной жидкости клеточной культуры определяют концентрацию конечных метаболитов оксида азота - нитритов с реактивом Грисса 1 (прототип). Недостатками прототипа являются изолированное определение базальной -продукции малоинформативно для оценки функции лейкоцитов у больных, так как каждый раз необходимо сравнение с показателями у здоровых лиц длительность культивирования отсутствует возможность раздельно оценить степень эндогенной активации лейкоцитови ответ на активациювследствие суммирования эффектов эндо- и экзогенных воздействий при культивировании свыше 6 часов. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в разработке оперативного и достоверного способа оценки функциональной активности лейкоцитов по способности к продукциив культуре. Задача решается за счет того, что способ оценки -продуцирующей активности лейкоцитов заключается в том, что одну часть лейкоцитов периферической крови культивируют в течение 3 часов в питательной среде со стимулятором продукции , а вторую часть - без указанного стимулятора, затем определяют уровень продукциилейкоцитами, культивируемыми в среде без добавления стимулятора Б, и уровень продукциилейкоцитами, культивируемыми в среде со стимулятором с, после чего рассчитывают функциональный -продуцирующий резерв ФР лейкоцитов по формуле, Б и при значении ФР более 1 -продуцирующую активность лейкоцитов определяют как неизмененную, а при значении ФР 1 или менее - как сниженную. В соответствии с предлагаемым способом к гепаринизированной венозной крови пациента добавляют равный объем 4 декстрана, смесь отстаивают 40 минут при комнатной температуре, верхний слой с лейкоцитами отбирают и разводят фосфатным буфером с 20 мМ ЭДТА, центрифугируют 10 минут при 200 . После удаления надосадочной жидкости эритроциты лизируют дистиллированной водой в течение 1 минуты с последующим восстановлением изотоничности, а лейкоциты дважды отмывают фосфатным буфером и суспендируют в питательной среде -1640 с антибиотиками (пенициллин 10 ЕД/мл,стрептомицин 10 мкг/мл) до концентрации 5106 клеток/мл. Суспензию лейкоцитов перед культивированием разделяют на две части, в одну из которых добавляют липополисахарид в качестве стимулятора в конечной концентрации 7 мкг/мл. Полученные культуры инкубируют при 37 С в течение 3 часов, после чего центрифугируют 10 минут при 200 ,в надосадочной жидкости каждой клеточной культуры определяют продукцию оксида азота по накоплению нитритов с реактивом Грисса. По результатам определения оксида азота в супернатантах интактных и стимулированных клеточных культур выполняют расчет функционального -продуцирующего резерва лейкоцитов по формуле, Б где ФР - функциональный резерв продукцииБ - уровень продукциив нестимулированных культурах лейкоцитов с - уровень продукциив стимулированных культурах лейкоцитов, стимулированных липополисахаридом. При значениях ФР 1,0 функциональный -продуцирующий резерв лейкоцитов является сниженным. 14883 1 2011.10.30 Разделение суспензии лейкоцитов перед культивированием на две части, одну из которых стимулируют добавлением липополисахарида, и сокращение сроков инкубации до 3-х часов позволяют одновременно определить базальную -продукцию по содержанию оксида азота в надосадочной жидкости нестимулированных лейкоцитов, а также уровень стимулированной -продукции по содержанию оксида азота в надосадочной жидкости лейкоцитов, стимулированных липополисахаридом. Базальный уровень продукциипозволяет оценить степень эндогенной активации лейкоцитов в случаях хронических инфекций, бактерионосительства и др., а уровень стимулированной липополисахаридом продукциипозволяет оценить функциональный -продуцирующий резерв лейкоцитов. Сокращение срока инкубации до 3-х часов позволяет избежать наложения эффектов эндо- и экзогенной стимуляции лейкоцитов. Данный подход обоснован тем, что фермент-синтезав неактивированных лейкоцитах обнаруживается в незначительном количестве или отсутствует, а 6-8 часов после добавления стимулятора необходимы для активации генов, синтеза м- , и самого фермента. В итоге при длительности культивирования свыше 6 часов эффекты эндогенной стимуляции -продукции и добавляемогоиндуктора накладываются и неразличимы. Кроме того, трехчасовой срок инкубации клеток позволяет получить в инкубационной среде достаточное для корректного определения количествобез снижения жизнеспособности клеток. Расчет функционального -продуцирующего резерва лейкоцитов необходим, так как он позволяет судить о состоянии компенсации бактерицидной -системы лейкоцитов и прогнозировать течение патологического процесса или стойкость ремиссии, во-вторых,ФР, отражая уровень базальной и стимулированной -продукции лейкоцитов каждого конкретного больного, исключает необходимость сравнения данных показателей с соответствующими значениями у здоровых лиц. Пример 1. Больная С., 44 года, поступила в отделение иммунопатологии и аллергологии ГУ РНПЦ РМиЭЧ с диагнозом хронический рецидивирующий фурункулез, тяжелое течение, стадия ремиссии. Обострения 4-6 раз в год. Выполнено лабораторное обследование,иммунофенотипирование, а также оценка фагоцитарной активности лейкоцитов, было взято 6 мл венозной крови для определения -продуцирующей активности лейкоцитов. К гепаринизированной венозной крови пациента был добавлен равный объем 4 декстрана, смесь отстаивалась 40 минут при комнатной температуре, верхний слой с лейкоцитами был отобран и разведен фосфатным буфером с 20 мМ ЭДТА, центрифугировался 10 минут при 200 . Эритроциты в осадке были лизированы дистиллированной водой, а лейкоциты отмыты фосфатным буфером, суспендированы в концентрации 5106/мл в питательной среде. Суспензия клеток была разделена на две части, в одну из которых был добавлен липополисахарид, 7 мкг/мл. Клеточные суспензии инкубировались 3 часа при 37 С, после чего в надосадочной жидкости с реактивом Грисса была определена концентрация нитритов и произведен расчет функционального -продуцирующего резерва лейкоцитов. Результаты исследований в иммунограмме фагоцитоз не нарушен, Б - 0,38 М/л- 0,53 М/л ФР - 1,39. Заключение снижение спонтанной и стимулированной продукциипри сохранении функционального резерва продукции . На основании клинических проявлений учетом выявленных нарушений функции лейкоцитов назначена иммуномодулирующая терапия. Пример 2. Больная И., 24 года, поступила в отделение иммунопатологии и аллергологии ГУ РНПЦ РМиЭЧ с диагнозом хронический рецидивирующий фурункулез, тяжелое течение, стадия обострения. Обострения до 6-8 раз в год. Проведено лабораторное обследование, иммунофенотипирование, а также оценка фагоцитарной активности лейкоцитов. Для 3 14883 1 2011.10.30 определения -продуцирующей активности лейкоцитов было взято 6 мл венозной крови, к которой был добавлен равный объем 4 декстрана. Смесь отстаивалась 40 минут при комнатной температуре, верхний слой с лейкоцитами был отобран и разведен фосфатным буфером с 20 мМ ЭДТА, центрифугировался 10 минут при 200 , эритроциты в осадке были лизированы дистиллированной водой, а лейкоциты отмыты фосфатным буфером и суспендированы в питательной среде в концентрации 5106/мл. Суспензия клеток была разделена на две части, одна из которых была стимулирована добавлением 7 мкг/мл липополисахарида. Клеточные суспензии инкубировались 3 часа при 37 С, после чего в надосадочной жидкости с реактивом Грисса была определена концентрация нитритов и произведен расчет функционального -продуцирующего резерва лейкоцитов. Результаты исследований показатели иммунограммы соответствуют стадии течения заболевания. Б - 0,65 М/л С - 0,26 М/л ФР - 0,40. Заключение снижение стимулированной продукции и функционального резерва продукции . С учетом выявленных изменений проведена терапия с хорошим эффектом. Примеры наглядно демонстрируют возможность выявления нарушений продукции по ФР при данной патологии. Преимущества предлагаемого способа заключаются в возможности оценки эндогенной активации клетокпо базальному уровню продукции , при этом данные, полученные у больных, сравниваются с показателями продукциилейкоцитами практически здоровых лиц в возможности определения функционального -продуцирующего резерва лейкоцитов в возможности применять для исследования бессывороточные питательные среды. Использование предлагаемого способа обеспечивает повышение достоверности диагностики, сокращает время проведения исследования, позволяет в короткие сроки разработать индивидуальную тактику лечения конкретного больного в зависимости от характера нарушений, тем самым способствует ускорению выздоровления больного. Способ позволяет провести исследование и получить результаты в течение одного рабочего дня без потери жизнеспособности клеток, оценить не только изначальную степень активации лейкоцитов, но и общий резерв системы продукции оксида азота. Способ может применяться для уточнения патогенетических механизмов развития различных заболеваний и позволяет получать дополнительные данные о состоянии неспецифической иммунологической резистентности у больных. Источники информации 1. Голиков П.П. и др. Генерация оксида азота лейкоцитами периферической крови в норме и при патологии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2003. -4. - С. 11-13. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4