Способ подготовки проб волос крупного рогатого скота к исследованию на макро- и микроэлементный состав

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ ВОЛОС КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ИССЛЕДОВАНИЮ НА МАКРОИ МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ(71) Заявители Коваленок Юрий Казимирович Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(72) Авторы Коваленок Юрий Казимирович Курдеко Александр Павлович Богомольцев Александр Валерьевич Совейко Евгения Игоревна(73) Патентообладатели Коваленок Юрий Казимирович Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(56)2304763 2, 2007.., 1998. - . 209. - . 2-3. . 185-192..., 1988. - . 77. - . 2-3. . 141-151...,1997. - . 13. - . 195-198.0574585 1, 1993. МУК 4.1.1482-03. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, поливитаминных препаратах с микроэлементами, в биологически активных добавках к пище и в сырье для их изготовления методом атомной эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной аргоновой плазмой.07-018563 , 1995.(57) Способ подготовки пробы волос крупного рогатого скота к исследованию на макро- и микроэлементный состав, включающий предварительное замачивание, очистку с контролем мутности промывного раствора, отличающийся тем, что замачивание осуществляют в воде при температуре 40-60 С в течение 2-3 часов, затем промывают замоченную пробу под проточной водой до исчезновения видимых загрязнений, а очистку проводят путем обработки промытой пробы ультразвуком частотой 35 кГц последовательно в бидистиллированной воде, 40 -ном водном растворе этилового спирта и снова в бидистиллированной воде, при этом обработку ведут в течение 1 часа в каждой среде. Изобретение относится к химической технологии и может быть использовано при подготовке проб биоматериала для исследования на макро- и микроэлементный состав,для очистки проб терминальных волос крупного рогатого скота. В медицинской литературе известно, что волос является более подходящей тканью,чем кровь или моча, для исследования баланса микроэлементов. Он является метаболически активным, простым и безболезненным при получении материалом. Волосы используются как предпочтительный тест-объект Агентством по защите окружающей среды США(АЗОС) для определения полученной дозы тяжелых металлов, для биологического мониторинга экологических антропогенных загрязнений окружающей среды. Однако интерполирование вопросов пробоподготовки волоса к описываемому исследованию из медицинской практики в ветеринарную недопустимо ввиду того, что волос животного находится в постоянном контакте с фекалиями и подстилочным материалом, что искажает результат исследования и не дает возможности объективной оценки минерального обмена в организме животного. В ветеринарии до настоящего времени не существует унифицированной методики подготовки проб волос животных к исследованию на макро- и микроэлементный состав. В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, таким образом заявляемое решение соответствует критерию изобретения новизна. Известен механический способ очистки (груминг) волосяного покрова длинношерстных животных (кошки, собаки, грива и хвост лошади), включающий чистку волоса гребнем,щеткой и т.д. Для очистки сильно загрязненных животных проводят мытье волосяного покрова нейтральным шампунем с тщательной отмывкой водой и высушиванием 2. Существуют щетки для волос с механизмом очистки 5. Такое устройство содержит корпус с прикрепленным к нему корпусом ручки, зубцы, установленные на рабочей поверхности корпуса, чистящий узел с чистящим элементом, накрывающим рабочую поверхность корпуса таким образом, что зубцы проходят через чистящий элемент. В щетку дополнительно введен узел управления чистящим узлом, состоящий из оси, установленной в корпусе, и полом корпуса ручки таким образом, что она проходит по оси их симметрии и обеспечивается ее вращение в корпусе и ручке. Недостатками указанных способов являются их гигиеническая цель, призванная проводить видимую очистку волоса, а также сложность их реализации для очистки проб исследуемого биоматериала, представляющего собой фрагменты волос. Помимо этого,данные способы не обеспечивают нужной для биохимического исследования степени очистки волос от экзогенных загрязнений. Известен способ очистки неорганических волокон от твердых частиц, используемый в химической, металлургической и других отраслях промышленности. Очистку осуществляют циклически. Пульпу, состоящую из воды и волокна, подогревают до 40-60 С и вращают в течение 2-3 мин с угловой скоростью 30-80 об/мин. Данный способ обеспечивает очистку неорганического волокна до нужной в промышленности степени его чистоты, однако не позволит достигнуть нужной степени чистоты исследуемой пробы волос для исследования на макро- и микроэлементный состав 6. Известен способ, применяемый при обработке шерсти в текстильной промышленности, заключающийся в очистке волокна в жидкой среде, сушке волокна мытой шерсти и дальнейшем воздействии низкотемпературной плазмой высокочастотного емкостного разряда в вакуумной камере в течение 180-300 с при рабочем давлении 13,0-30,0 Па, расходе плазмообразующего газа аргона 0,03-0,05 г/с, плотности ионного тока 0,2-0,7 А/м 2. Недостатками способа являются невозможность его применения в лабораторной ветеринарной практике, трудоемкость и значительные энергозатраты 7. При определении изменений в биологической системе макро- и микроэлементного гомеостаза у человека при различных заболеваниях по способу 4 предварительная очистка волоса не проводится. У животных данный способ применять нецелесообразно ввиду сильной загрязненности исследуемого материала, что вносит высокую погрешность в результаты исследований. Известен способ очистки проб биоматериала от экзогенных загрязнений для последующего их анализа на содержание макро- и микроэлементов (МАГАТЭ). Способ предусматривает очистку волос в моющей среде последовательно моющими средствами ацетонвода-ацетон. При этом контроль степени очистки представляет собой сложную и длительную технологию определения элементного состава исходных (загрязненных) волос, промывных растворов и отмытых волос 8. 2 16846 1 2013.02.28 Недостатком такого способа является разрушение жировой и кератиновой структуры волоса при обработке его ацетоном, что приводит к потере эндогенных макро- и микроэлементов. Это существенно снижает достоверность проводимого далее анализа. Известен способ подготовки волоса человека, когда накануне исследования волосы моют мылом и хорошо промывают водой. Недостатком данного способа является то, что на пробе волос могут остаться следовые количества мыла, которые содержат макро- и микроэлементы 3. Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ подготовки пробы терминальных волос крупного рогатого скота к анализу на содержание макро- и микроэлементов, включающий замачивание волос на 10-12 ч, а затем воздействие на нее моющей среды, в качестве которой используется вода, с контролем степени очистки волос от экзогенных загрязнений. Воздействие осуществляют механическим путем обеспечения высокоскоростного вихревого движения пробы в моющей среде в течение 1 ч, обеспеченного использованием миксера с двумя насадками кругового вращения до 1000 об/мин. Степень очистки контролируют путем оценки мутности промывного раствора 1. Недостатками данного способа являются длительность пробоподготовки, механическое повреждение структуры волоса с потерей эндогенных микроэлементов, потери измельченного волоса, использование бытовых приборов, низкая технологичность способа в лабораторном производстве. Задачей предлагаемого технического решения является полная очистка исследуемого материала от экзогенных загрязнений без потерь эндогенных макро- и микроэлементов при минимальных временных, энергетических и финансовых затратах. Технический результат достигается тем, что, в отличие от известного способа, предлагается способ очистки, заключающийся в том, что пробы волос замачивают в теплой (4060 С) воде в течение 2-3 ч, промывают под проточной водой до исчезновения видимых загрязнений, далее очищают в ультразвуковой ванне, используя последовательно следующие моющие среды бидистиллированная вода - 40 -ный водный раствор этилового спирта- бидистиллированная вода (1 ч в каждой среде). При этом степень очистки волоса контролируется путем оценки мутности промывающего агента и микроскопического исследования волоса. В предлагаемом способе не требуется использование бытовых приборов, а предварительное замачивание сокращается до 2-3 ч (в зависимости от степени загрязнения исходной пробы). Использование ультразвуковой ванны, по сравнению с применением бытового миксера, предотвращает потери эндогенных микроэлементов вследствие повреждения структуры волоса вращающимися насадками. Ультразвуковая ванна позволяет готовить к исследованию одновременно несколько проб (в зависимости от объема ванны и способа помещения в нее пробы). Применение в качестве промывающего агента воды исключает вымывание из пробы эндогенных макро- и микроэлементов. Очищающее воздействие ультразвука заключается в образовании в моющей жидкости чередующихся высоких и низких волн давления, которые создают кавитацию, то есть образуют множество микроскопических пузырьков, при соприкосновении с волосом обеспечивающих возникновение множества микровзрывов, отрывающих экзогенные частицы, не повреждая при этом структуру самого волоса. 40 -ный водный раствор этилового спирта является хорошим растворителем, при этом не повреждает структуру волоса и не приводит к потерям эндогенных макро- и микроэлементов. Степень очистки волоса после пробоподготовки контролируют посредством измерения оптической плотности конечного промывающего агента и световой микроскопии. При этом на 1 см волоса, подготовленного к исследованию по заявляемому способу, отмечалось 0,11 экзогенные частицы, а на 1 см волоса, подготовленного по известному способу,приходилось 2,3 экзогенные частицы. Нами впервые показано, что достижение технического результата очистки загрязненных волос животных для исследования на макро- и микроэлементный состав возможно 3 16846 1 2013.02.28 при последовательном использовании промывающих сред бидистиллированная вода 40 -ный этиловый спирт - бидистиллированная вода, с обработкой в ультразвуковой ванне акустической волной с рабочей частотой колебания 35 кГц. Следовательно, изобретение соответствует критерию изобретательский уровень. Способ осуществляется следующим образом 1. Проба длинных терминальных волос КРС массой не менее 2 г погружается в лабораторный стакан объемом 50 мл с теплой водой (40-60 С) на 2-3 ч. 2. По истечении указанного времени воду сливают, а лабораторный стаканчик помещают под проточную воду с большим напором и проводят отмывание волос до исчезновения видимых загрязнений, разбивая их стеклянной палочкой. 3. Затем пробу заливают бидистиллированной водой, а стаканчик с ней помещают в ультразвуковую ванну (рабочая частота 35 кГц) на 1 ч. 4. По истечении указанного времени воду сливают, пробу заливают 40 -ным водным раствором этилового спирта и снова помещают на 1 ч в ультразвуковую ванну. 5. Затем спирт сливают, пробу заливают бидистиллированной водой и снова подвергают очистке в ультразвуковой ванне в течение 1 часа. 6. Контроль мутности промывного раствора осуществляют посредством измерения его оптической плотности. 7. Пробу высушивают в сушильном шкафу при 40 С и исследуют посредством МСИСП. Для сравнительного анализа параллельно проведена подготовка проб по двум способам - заявляемому и прототипу. Всего было исследовано 840 проб волос. Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов пробоподготовки волоса крупного рогатого скота к исследованию представлена в табл. 1. Таблица 1 Сравнительная характеристика способов подготовки проб волос к исследованию на макро- и микроэлементный состав Показатель Время предварительного замачивания Промывающий агент Использование приборов Повреждение структуры волоса Возможность одновременной подготовки нескольких проб Экстинкция промывающего агента на последней стадии отмывки волоса Количество экзогенных частиц на 1 см готового к исследованию волоса вода, 40 -ный водный раствор этилового спирта бытовой миксер, сушильный лабораторная ультразвукошкаф вая ванна, сушильный шкаф происходит посредством механического воздействия отсутствует насадок миксера нет да использование миксера число одновременно изгоопускает одномоментную тавливаемых проб зависит от подготовку только одной объема ультразвуковой ванны пробы вода Представленные в табл. 1 данные демонстрируют определенные различия в получаемом техническом результате пробоподготовки волоса к исследованию. Наиболее значи 4 16846 1 2013.02.28 мые различия состоят в установленном повреждающем механическом действии насадок миксера на структуру волоса (потери эндогенных микроэлементов), а также то, что при одинаковой конечной степени экстинкции промывающего агента на пробах волос, подготовленных известным способом, остаются значительные количества внешних загрязнений. Указанные различия, полученные экспериментальным путем, могут оказать существенное влияние на объективность получаемого результата. Проведенный анализ 840 проб волос животных на содержание макро- и микроэлементов посредством МС-ИСП выявил определенные различия, представленные в табл. 2. Анализ достоверности различий между макро- и микроэлементным составом проб, подготовленных разными способами, был проведен с использованием критерия Манна-Уитни . Таблица 2 Содержание макро- и микроэлементов в пробах волос крупного рогатого скота,подготовленных различными способами Содержание макро- и микроэлеСпособПредлагаемый способ ментов в пробе, мг/кг 2304763 7 45 0,00000,0000 0,00000,0000 9 15 0,00000,0000 0,00000,0000 23 23,98530,2213 24,65780,2543 2 24 5 339,757625,2217 342,457221,2215 27 30 2,52480,1416 2,52750,1116 39 8 32,3226,1478 32,3284,1278 44 6 233,156528,1576 233,262124,6211 51 34 0,00000,0000 0,00000,0000 52 32 0,79390,0041 0,79220,0021 55 28 7,69480,0145 7,70200,0254 57 12 14,02531,1200 14,01861,5210 59 11 0,07840,0014 0,07780,0016 60 18 0,00010,0000 0,00010,0000 63 8 5,56340,0014 5,55210,0018 66 5 99,52124,0015 98,51463,0085 71 32 0,00000,0000 0,00000,0000 75 24 0,00000,0000 0,00000,0000 78 41 0,00000,0000 0,00000,0000 85 14 0,00000,0000 0,00000,0000 88 12 3,01820,1900 3,02140,2145 107 11 0,00000,0000 0,00000,0000 114 18 0,03830,0010 0,03880,0014 115 14 0,00000,0000 0,00000,0000 133 32 0,00000,0000 0,00000,0000 137 11 1,77990,0580 1,78210,0482 202 12 0,00000,0000 0,00000,0000 205 23 0,00000,0000 0,00000,0000 208 54 0,00000,0000 0,00000,0000 209 12 0,02830,0014 0,02920,0162 Анализ табл. 2 показывает, что содержание натрия, магния, кальция и калия в пробах волос, подготовленных по известному способу, достоверно выше, нежели в пробах, под 5 16846 1 2013.02.28 готовленных по заявляемому способу. При этом содержание меди и цинка в пробах, подготовленных известным способом, наоборот, достоверно ниже. Указанные различия указывают на факт потери эндогенного микроэлементного пула проб волос вследствие механического их повреждения насадками миксера и усугубляемое искажение результата механическими примесями, оставшимися после пробоподготовки. Таким образом, предлагаемый способ подготовки проб терминальных волос КРС для исследования на макро- и микроэлементный состав позволяет достичь необходимой степени чистоты пробы с минимальными временными, энергетическими и трудовыми затратами. Источники информации 1. Патент 2304763 2. 2. Домашний доктор для кошек и собак / Под ред. Н.Ярошенко. - М. Ридерз Дайджест,2003. - С. 138-140. 3. Кустаров В.Н. Изучение микроэлементного состава волос женщин в репродуктивном и пременопаузальном периодах // Российский вестник акушера-гинеколога. - Т. 3.4. - 2003. - С. 23-25. 4. Патент 2180121 1. 5. Патент 2186514 1. 6. Патент 2326196 2. 7. Патент 2378422 2. 8.,.,. / . . . - 455. - 2002. - . 23-34. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6