Способ оценки функциональной активности лимфоцитов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ(71) Заявитель Белорусский научно-исследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(73) Патентообладатель Белорусский научноисследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(57) Способ оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови, включающий стимуляцию культуры лейкоцитов митогеном и определение количества лимфоцитов, несущих специфические рецепторы в реакции розеткообразования в контрольной и опытной культурах, отличающийся тем, что стимуляцию осуществляют фитогемагглютинином не менее 16 часов, а затем определяют количество лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 с помощью частиц, нагруженных рекомбинантным интерлейкином 2, и при соотношении между опытом и контролем более 15 определяют нормальную функциональную активность лимфоцитов. Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии и может быть использовано для оценки функциональной активности лимфоцитов при изучении иммунного статуса человека. Оценку функциональных свойств лимфоцитов проводят при их культивировании, изучая бластрансформацию под влиянием митогенов - фитогемагглютинина (ФГА). О функциональной активности лимфоцитов судят по числу бластных клеток, обнаруживаемых после 5 суток культивирования в присутствии ФГА 2. Наиболее близким решением, выбранным в качестве прототипа, является способ морфологического учета реакции бластной трансформации. Лимфоциты здорового организма в присутствии специфического антигена в культуре клеток в течение не менее, чем 5 суток, переходят в бластные формы, которые регистрируются при специальном окрашивании в световом микроскопе 1. Описанный способ имеет следующие недостатки 1) требования дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала, абсолютной стерильности 2) обязательное использование дорогостоящих, высококачественных сред для культивирования, сохраняющие жизнеспособность лимфоцитов не менее 5-7 суток 3) значительная вариация результатов, которая связана с длительностью инкубирования культуры лимфоцитов и значительной долей субъективизма при морфологическом учете бластных форм 2743 1 4) сроки культивирования составляют 5 суток и более, что существенно снижает диагностическое значение теста для конкретных пациентов 5) трудоемкость морфологического учета бластных форм. Общими с прототипом признаками являются 1) техника культивирования лейкоцитов периферической крови (забор крови, митоген, постановка опытной и контрольной культур и т.д.) 2) морфологический учет результатов реакции 3) вынесение суждения о сенсибилизации по разнице между результатами между опытной и контрольной культурами. Задачей изобретения является сокращение времени проведения реакции. Поставленная задача достигается следующим образом. Заявляемый способ основан на оценке ранних активационных маркеров (рецепторы к интерлейкину 2) в краткосрочной культуре лимфоцитов. Для этого венозную кровь с антикоагулянтом (гепарин - 20 Ед/мл) отстаивают при 37 С и плазму со взвешенными лейкоцитами разводят средой 199 (гентамицин 1 мг/мл) в соотношении 15 (концентрация лейкоцитов 1-2106/мл). Разведенную средой 199 плазму с лейкоцитами объемом 1,0-2,0 мл на одну культуру(из расчета 2.00.5 млн. лейкоцитов) вводят в стерильные пенициллиновые флаконы, в опытную культуру вносят ФГА (заранее оттитровывается субагглютинирующая доза), газовую среду насыщают углекислотой флаконы герметически закупоривают и ставят в термостат при 37 С не менее чем на 16 часов. Затем отмывают забуференным физиологическим раствором и оценивают способность к розеткообразованию с частицами,несущими ИЛ 2. Диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 готовят следующим образом эритроциты быка тщательно отмывают забуференным физиологическим раствором до исчезновения в супернатанте следов белка. 1 мл эритроцитов, упакованных центрифугированием (1000 об/мин., 15 мин.) смешивают с 2,5 раствором глютарового альдегида в общем объеме 20 мл. Инкубируют 24 часа при 4 С с периодическим встряхиванием и отмывают от глютарового альдегида. Препарат рекомбинантного интерлейкина 2 (рИЛ 2) разводят в 1,0 мл дистиллированной воды и добавляют к осадку эритроцитов, после чего ресуспендируют и инкубируют 24 часа на холоде. Непрореагировавшие альдегидные группировки блокируют 0,1 раствором человеческого сывороточного альбумина. Хранят в осажденном состоянии в присутствии 0,1 азида натрия срок хранения препарата без потери активности - 6 месяцев. Число лимфоцитов в аликвотах культуры клеток доводят до концентрации 2-3106/мл диагностикум - до 50-75106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лимфовзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкл 0.05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 790 и масляную иммерсию оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов. Пример. Больной Т., 5 лет. Клинический диагноз Хронический обструктивный бронхит, рецидивирующее течение, ДН 1. Венозную кровь с гепарином (10 Ед/мл) отстаивают при 37 С и плазму со взвешенными лейкоцитами разводят средой 199 (гентамицин 1 мг/мл) в соотношении 15 (концентрация лейкоцитов составила 1106/мл). Плазму с лейкоцитами объемом по 2,0 мл вносят в 2 стерильных пенициллиновых флакона, в один из которых добавляют ФГА (15 мкг/мл), газовую среду насыщают углекислотой флаконы герметически закупоривают и ставят в термостат при 37 С на 16 часов. Затем отмывают забуференным физиологическим раствором (2.0 мл на 1 культуру, 2-ды), осадок разводят в 0.3 мл забуференного физиологического раствора (число лимфоцитов 3106/мл) диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 - приготовленный как описано выше - разводят до 75106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лимфовзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкл 0.05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 790 и масляную иммерсию, оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов в контрольной культуре он составил 11 , в стимулированной митогеном - 19 . Разница между опытной и контрольной культурами - 8 , из чего выносят суждение о функциональной недостаточности лимфоцитов. Таким образом, предложенный способ позволяет оценивать функциональную активность лимфоцитов его преимущества перед традиционными 2743 1 1) укорочение сроков культивирования в 8 раз и повышение за счет этого точности реакции, т.к. исключается влияние вариаций качественного и количественного состава среды культивирования 2) более низкие требования к качеству оборудования, квалификации персонала, стерильности 3) лучшая воспроизводимость результатов 4) простота учета результатов 5) широкие возможности, по сравнению с реакцией бластной трансформации лимфоцитов, применения в рутинной клинико-лабораторной практике. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3