Пептидный субстрат для связывания Fc-фрагмента иммуноглобулина класса G

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПЕПТИДНЫЙ СУБСТРАТ ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ -ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА КЛАССА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Лапко Анастасия Викторовна Макаревич Денис Александрович Мартинович Вера Павловна Голубович Владимир Петрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Пептидный субстрат формулы для связывания -фрагмента иммуноглобулина класса . Данное изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новому пептидному субстрату формулы (где- фенилаланинглутамин - - тирозин метиловый эфир), который может связываться с фрагментом иммуноглобулинов классаподобно нативному протеинуклеточной стенки. Протеинклеточной стенкиучаствует во многих защитных биологических функциях, включая противоопухолевую и токсическую, действует как иммуномодулятор, способен вызывать ответ типа 1, приводящий к производству цитокинов, используется в методах иммуноадсорбции для лечения протеинурии при нефротическом синдроме и серьезных аутоиммунных заболеваний и др. 1. Наиболее распространенными субстратами, используемыми в клинической практике,являются нативный протеини -домен протеина 2. Однако они имеют достаточно высокую рыночную стоимость и получение этих субстратов характеризуется сложностью и специфичностью. Аналогов заявляемого пептидного субстрата не выявлено. Задача изобретения - создание нового пептидного субстрата (тетрапептида) с формулой . Заявляемый пептидный субстрат может быть использован для удаления иммуноглобулинов классаиз биологических жидкостей человека и может найти практическое применение в медицинской практике. Для решения данной задачи с помощью методов теоретического конформационного анализа отобрана структура заявляемого тетрапептида, аминокислотные остатки которого входят в состав активного центра протеина , обеспечивающего его связывание с 15836 1 2012.04.30 фрагментом иммуноглобулинов класса , и осуществлен синтез заявляемого пептидного субстрата. Способ получения заявляемого пептидного субстрата приведен в примере 1. Пример 1. Синтез пептидного субстрата . Пептид получают с использованием классических методов пептидного синтеза. Основной метод образования пептидной связи - карбодиимидный, в качестве конденсирующего агента используют диизопропилкарбодимид, противорацемической добавки - 1-оксибензотриазол. Для блокирования -аминогрупп используют третбутилоксикарбонильную защиту. Ее отщепление проводят обработкой пептидов 3,5 5,0 н. растворомв этилацетате. Карбоксильные группы блокируют путем образования метиловых эфиров. Структура синтезированных пептидов подтверждена методами масс-спектрометрии,аминокислотного анализа, ВЭЖХ, ТСХ. Масс-спектры целевых пептидов получают на масс-спектрометре 150 ( , США) с использованиемисточника ионов. Аналитическую ВЭЖХ синтезированных соединений проводят на хроматографе фирмы(32, 966 фотодиодный детектор, колонка 2015218 (2.1250 мм. Используемый градиент концентраций от 10 до 40 ацетонитрила в воде с добавлением 0,1. Скорость потока 1 мл/мин. Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках Сорбфил, Россия. Хроматографические подвижности приведены в системах(В) - бутанол/уксусная кислота/вода, 401010. Удельное вращение опредяют на спектрополяриметре -20 (, Япония). Температуры плавления определяют на приборе Кофлера. Разработанная схема синтеза включает 6 синтетических стадий.. 0,536 г (1,2 ммоль) дициклогексиламмонийной соли третбутилоксикарбонил-фенилаланина и 0,287 г (1,2 ммоль) гидрохлорида метилового эфира тирозина растворяют в 3 мл смеси хлористого метилена и ДМФ 11, затем раствор охлаждают до 0 С и прибавляют последовательно 0,19 г (1,25 ммоль) НОВТ и 0,258 г (1,25 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 1 час при охлаждении и 6 часов при комнатной температуре. После окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 1 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 30 мл этилацетата, и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, водой, сушат над 24. После отгонки этилацетата образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира гексаном и сушат над 25. Выход - 0,44 г (86 ) в виде белого кристаллического порошка. 20 - 7,0 ( 1, ) Т. пл. 83-87 С 0,76 , 0,77 . Получение фенилаланил-тирозина метилового эфира, гидрохлорида (-). К 0,39 г (0,9 ммоль) прибавляют 4 млв этилацетате, прозрачный раствор перемешивают 30 мин магнитной мешалкой, затем упаривают на роторном испарителе, остаток промывают эфиром (трижды), сушат в вакуум-эксикаторе над 25. Выход - 0,30 г (92 ). 2011,0 ( 1, ) Т. пл. 63-67 С 0,29 15836 1 2012.04.30 К раствору 0,270 г (0,75 ммоль) гидрохлорида метилового эфира фенилаланилтирозина в 2,5 мл ДМФ прибавляют 0,11 мл -метилморфолина (1,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут, затем прибавляют 0,197 г (0,80 ммоль) третбутилоксикарбонил-глутамина. После охлаждения до 0 С в реакционный сосуд вносят последовательно 0,14 г (0,9 ммоль) НОВТ и 0,165 г (0,8 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0 С и 5 ч при комнатной температуре. После окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 1 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 30 мл этилацетата, и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, водой, сушат над 24. После отгонки этилацетата образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира гексаном и сушат над 25. Выход - 0,33 г (80 ) , 20 - 22,0 ( 1, ) Т. пл. 108-109 С 0,76 (Б), 0,71 (В).. К 0,30 г (0,54 ммоль) прибавляют 3 мл НС в этилацетате, реакционную смесь встряхивают на шейкере в течение 30 мин, затем прибавляют 5 мл эфира. С образовавшегося гигроскопичного осадка сливают надосадочную жидкость, промывают его эфиром (33 мл), сушат в вакуум-эксикаторе над Р 205. Выход 0,24 г (91 ). 20 - 6,0 ( 1, )0,26 (Б), 0,38 (В).. Получение -третбутилоксикарбонил-фенилаланил-глутаминил-фенилаланилтирозина метилового эфира . 0,223 г (0,5 ммоль) дициклогексиламмонийной соли третбутилоксикарбонил-фенилаланина и 0,221 г (0,45 ммоль) гидрохлорида метилового эфира тирозина растворяют в 2 мл смеси хлористого метилена и ДМФ 11, затем раствор охлаждают до 0 С и прибавляют последовательно 0,093 г (0,5 ммоль) НОВТ и 0,103 г (0,5 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 1 час при охлаждении и 6 часов при комнатной температуре. После окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 0,1 мл хлористого метилена. Затем хлористый метилен упаривают, к диметилформамидному раствору прибавляют 10 мл эфира. Выпавший объемный осадок отделяют фильтрованием,промывают эфиром (22 мл). После сушки в вакуум-эксикаторе над Р 2 О 5 получают 0,25 г Получение заявляемого тетрапептида фенилаланил-глутаминил-фенилаланилтирозина метилового эфира, гидрохлорида . К 0,218 г (0,31 ммоль) прибавляют 2,5 мл НС в этилацетате, реакционную смесь встряхивают на шейкере в течение 30 мин, затем прибавляют 4 мл эфира. С образовавшегося гигроскопичного осадка сливают надосадочную жидкость,промывают его эфиром (33 мл), петролейным эфиром (23 мл), сушат в вакуумэксикаторе над Р 205. Выход - 0,186 г (94 ) в виде белого объемного мелкокристаллического порошка. 20 - 16,0 ( 1, )0,41 (Б), 0,47 (Д). Активность заявляемого тетрапептида подтверждена исследованиями аффинности связывания с -фрагментом иммуноглобулинов , приведенными в примере 2. Пример 2. Определение аффинности связывания пептидного субстрата с -фрагментом иммуноглобулинов класса . Для оценки соответствия функции связывания синтезированного тетрапептидного аналога активного центра протеинас -фрагментом иммуноглобулинов использовался иммуноферментный анализ 3. В качестве иммуноферментной тест-системы был использован наборобщий - ИФА - БЕСТ фирмы Вектор Бест(Новосибирск, Россия), предназначенный для иммуноферментного определения концен 3 15836 1 2012.04.30 траций общего иммуноглобулина классав сыворотке крови и других биологических жидкостях человека в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях. Непосредственно перед проведением анализа получают комплекс заявляемого тетрапептида с -фрагментом общегов различных молярных соотношениях 41 21 11 0,51 0,251 0,1251 0,0641 соответственно. Комплекс инкубируют при 37 С в течение 30 минут. Анализ проводится в две стадии. На первой стадии калибровочные образцы с известной концентрациейи анализируемые образцы комплекса тетрапептид - фрагмент , а также контрольные образцы (нулевой контроль и контрольный образец) инкубируются в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (1) к тяжелым цепям . Затем планшет отмывается промывочным буфером. На второй стадии связавшийся в лункахобрабатывается конъюгатом 2 к легким (лямбда и каппа) цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой. После отмывания избытка указанного конъюгата образовавшиеся иммунные комплексы иммобилизованные 1 - -конъюгат выявляются ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена (тетраметилбензидина). Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрациив анализируемом образце и обратно пропорциональна количеству образовавшегося комплекса антитела с тетрапептидом. После остановки пероксидазной реакции стопреагентом результаты учитываются фотометрически. Концентрацию связавшегосяв образцах определяют по калибровочному графику. Проведенный анализ показал, что существует определенная зависимость процента связыванияс иммобилизованными моноклональными антителами в присутствии тетрапептида в различных соотношениях. Установлено, что при увеличении молярного соотношения в сторонупроцент ингибированияучастка также растет и достигает плато при соотношении 11. Полученные данные свидетельствуют о том, что при проведении иммуноферментного анализа образуется устойчивый комплекс -фрагмента иммуноглобулинаи синтезированного тетрапептида, который не связывается с иммобилизованными антителами. Таким образом, заявляемый тетрапептид является функционально активным в отношении -фрагмента иммуноглобулинаи может найти применение в медицине для проведения иммуносорбционной терапии, при выделении и очистке антител, а также в качестве субстрата и реагента в научных экспериментах. Источники информации 1.. //. - 1970. - . 2. - . 5. - . 672-673. 2.,,, //. 1999. - . 8. - . 1423-1431. 3. Егоров , Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. - М. Высшая школа,1991. - 288 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4