Вирусвакцина культуральная против чумы плотоядных животных и способ ее получения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВИРУСВАКЦИНА КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ковалев Николай Андреевич Усеня Михаил Михайлович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(57) 1. Вирусвакцина культуральная против чумы плотоядных животных, содержащая аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных, выращенный в культуре клеток, отличающаяся тем, что в качестве аттенуированного штамма содержит штамм вирусаКМИЭВ-12, выращенный в культуре клеток 9-10-дневных куриных эмбрионов на поддерживающей среде, содержащей 5 гемогидролизата и 2-5 сыворотки крови крупного рогатого скота, и лиофилизированный, причем перед лиофилизацией к вируссодержащей жидкости с титром 4,0-5,0 ТЦД 50/см 3 добавляют среду высушивания, содержащую 6-9 сахарозы, 1-3 желатина и 0,15-0,25 агара микробиологического из расчета на 3 части вируссодержащей жидкости 1 часть среды высушивания. 2. Способ получения вирусвакцины культуральной против чумы плотоядных животных, включающий выращивание культуры клеток в ростовой питательной среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота, инфицирование культуры клеток аттенуированным вирусом чумы плотоядных с одновременной заменой ростовой питательной среды на поддерживающую, культивирование клеток с вирусом, сбор вируссодержащей жидкости, добавление среды высушивания и лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют культуру клеток 9-10-дневных куриных эмбрионов,которую выращивают на ростовой питательной среде, содержащей 5 гемогидролизата и 12-16 сыворотки крови крупного рогатого скота, при рН от 7,2 до 7,4 и температуре 370,5 С, инфицирование культуры клеток проводят в дозе 1-5 вирусных частиц на клетку аттенуированным штаммомКМИЭВ-12, при этом используют поддерживающую среду, содержащую 5 гемогидролизата и 2-5 сыворотки крупного рогатого скота, вируссодержащую жидкость собирают при достижении цитопатогенного эффекта не менее чем у 70 инфицированных клеток, а в качестве среды высушивания используют среду, содержащую 6-9 сахарозы, 1-3 желатина и 0,15-0,25 микробиологического агара, причем добавляют ее из расчета 1 часть среды высушивания на 3 части вируссодержащей жидкости. 9666 1 2007.08.30 Изобретение относится к области получения биопрепаратов и может быть использовано в биологической промышленности и ветеринарии для массовой профилактики заболевания чумой у домашних плотоядных и промысловых плотоядных животных. Известна вирусвакцина против чумы плотоядных, содержащая в своем составе вирус чумы плотоядных с титром 106,5-106,7 ИД 50/мл, выращенного на культуре клеток куриного эмбриона с использованием питательной среды ферментативного белкового гидролизата и сыворотки крови крупного рогатого скота 1. Эта вирусвакцина обладает недостатком, характеризующаяся тем, что для определения ее иммуногенности требуется использование дорогостоящих, достаточно редких промысловых животных, в частности тхорзофредок. Кроме того, для ее производства требуется микроноситель ДЭАЕ-2,5, который в Республике Беларусь не производится. Этот недостаток отсутствует в живой аттенуированной лиофилизированной вакцине против чумы плотоядных, которая характеризуется тем, что содержит в 1,0 мл не менее 103 ТЦД 50 частиц вируса чумы плотоядных, штамм 10/88-289, адаптированного к культуре клеток. Для приготовления вакцины используют среду Паркера 2. Эта вакцина обладает недостатком, характеризующимся тем, что для ее приготовления используют среду Паркера, которая в Республике Беларусь не производится. Кроме того, вакцина имеет сравнительно низкий титр вируса - 103 ТЦД 50/мл, что свидетельствует о ее сравнительно низкой эффективности. Известна вирусвакцина культуральная против чумы плотоядных животных, содержащая в своем составе аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных ЭПМ-10-76, культивируемый на культуре клеток японских перепелов с использованием питательной среды Паркера 3. Эта вакцина имеет недостатки заключающиеся в том, что она имеет сравнительно невысокий титр, а это свидетельствует о более низкой ее эффективности. Для ее производства требуется питательная среда Паркера, которая в Республике Беларусь не производится. Известные способы получения заявляемой вакцины не позволяют ее получить в виду того, что в известных способах используются дорогостоящие импортные компоненты и которые не обеспечивают надлежащей эффективности вакцины. Известен способ получения вирусвакцины против чумы плотоядных, включающий выращивание клеток куриного эмбриона в ростовой среде, состоящей из ферментативного белкового гидролизата и сыворотки крови крупного рогатого скота, заражение клеток аттенуированным штаммом вируса чумы плотоядных одновременно со сменой ростовой среды на поддерживающую, культивирование клеток с вирусом, добавление к вируссодержащей жидкости стабилизатора и лиофилизация полученной смеси 4. Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что для выращивания клеток куриного эмбриона используют микроноситель ДЭАЕ-2,5, который в Республике Беларусь не производится и его закупка требует валютных затрат. Известен способ получения вирусвакцины против чумы плотоядных на основе аттенуированного штамма 10/88-289 в культуре клеток куриных эмбрионов с использование питательной среды Паркера 5. Этот способ имеет недостаток, заключающийся в том, что питательная среда Паркера в Республике Беларусь не производится. Известен способ получения вирусвакцины культуральной против чумы плотоядных животных, включающий получение и выращивание аттенуированного штамма вируса чумы плотоядных в культуре клеток японских перепелов на среде Паркера 6. Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что в качестве источника культуры клеток используют культуру клеток японских перепелов, которые имеют невы 2 9666 1 2007.08.30 сокий выход клеток, кроме того, в Республике Беларусь японские перепела встречаются редко. Задачей предлагаемого изобретения является конструирование высокоиммуногенной,сравнительно дешевой вакцины для профилактики чумы плотоядных и разработка способа ее получения с использованием компонентов отечественного производства. Поставленная задача достигается тем, что в вирусвакцине культуральной против чумы плотоядных животных, содержащей аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных,выращенный в культуре клеток, - в качестве аттенуированного штамма используют штаммКМИЭВ-12, выращенный в культуре клеток 9-10 дневных куриных эмбрионов на поддерживающей среде, содержащей 5 гемогидролизата и 2-5 сыворотки крови крупного рогатого скота и лиофилизированный, причем перед лиофилизацией к вируссодержащей жидкости с титром 4,0-5,0 ТЦД 50/см 3, добавляют среду высушивания, содержащую 6-9 сахарозы, 1-3 желатина и 0,15-0,25 агара микробиологического из расчета на 3 части вируссодержащей жидкости 1 часть среды высушивания. Кроме того, поставленная задача достигается тем, что в способе получения вирусвакцины культуральной против чумы плотоядных животных, включающем выращивание культуры клеток в ростовой питательной среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота инфицированием культуры клеток аттенуированным вирусом чумы плотоядных с одновременной заменой ростовой питательной среды на поддерживающую, культивирование клеток с вирусом, сбор вируссодержащей жидкости, добавление среды высушивания и лиофилизацию, - в качестве культуры клеток используют культуру клеток 910-ти дневных куриных эмбрионов, которую выращивают на ростовой питательной среде содержащей 5 гемогидролизата и 12-16 сыворотки крови крупного рогатого скота,при величине рН 7,2-7,4, температуре 370,5 С, инфицирование культуры клеток проводят в дозе 1-5 вирусных частиц на клетку аттенуированным штаммом вирусаКМИЭВ-12, при этом используют поддерживающую питательную среду, содержащую 5 гемогидролизата и 2-5 сыворотки крови крупного рогатого скота, вируссодержащую жидкость собирают при достижении цитопатического эффекта не менее чем у 70 инфицированных клеток, а в качестве среды высушивания используют среду, содержащую 6-9 сахарозы, 1-3 желатина и 0,15-0,25 агара микробиологического, причем добавляют ее из расчета 1 часть среды высушивания на 3 части вируссодержащей жидкости. Штамм вируса чумы плотоядных КМИЭВ-12 адаптирован к культуре клеток куриных фибробластов, культивируемых в ростовой и поддерживающей питательной среде, содержащей 5 -ный гемогидролизат, соответствующей требованиям ФС 42-46 ВС-87. Видовое название. Штамм имеетКМИЭВ-12. Штамм получен от собаки больной чумой плотоядных путем выделения на культуре клеток. Штамм депонирован и хранится в музее культур микроорганизмов РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси. Культурально-морфологические свойства диаметр частиц 110-160 нМ, полиморфен,чаще сферической формы, наружная оболочка имеет радиально расположенные выступы длинной 9-13 мкМ. Инфекционная активность штамма время инкубации на культуре клеток куриных фибробластов 144-192 часа при температуре 370,5 С, титр вируса 4,5-5,0 ТЦД 50/см 3. Антигенная активность при экспериментальном заражении серонегативных щенков восприимчивых плотоядных животных индуцирует образование вируснейтрализующих антител. 3 9666 1 2007.08.30 Безвредность штамм безвреден для собак, лисиц, песцов, норок, а также лабораторных животных- кроликов, белых мышей, морских свинок. Физико-биохимические свойства вирус слабо устойчив к высоким температурам, при 110 С вирус погибает в течение 15 минут, минусовые температуры действуют консервирующе. Прямые солнечные лучи инактивируют его в течение 14 часов. Формальдегид в концентрации 0,1 инактивирует его в течение 2 часов. Штамм вируса оказывает цитопатогенное действие в культуре клеток куриных фибробластов. Штамм не обладает онкогенными свойствами. Штамм не обладает реверсибельностью. Штамм хранится в замороженном состоянии при температуре не выше минус 20 С или в лиофилизированном состоянии при температуре не выше 4 С и поддерживается методом субкультивирования на культуре клеток куриных фибробластов. Питательная среда с гемогидролизатом (5 ) для культур клеток рН 7,20,2 соответствует ФС 42-46 ВС-87 7. Пример Способ приготовления вирусвакцины культуральной против чумы плотоядных осуществляется следующим образом. Трипсинизированные клетки куриного эмбриона в концентрации 300-400 тыс.клеток/мл в ростовой питательной среде, состоящей из 5 -ного гемогидролизата (ФС 42-46 ВС-87) с 12-16 сыворотки крови крупного рогатого скота, выращивают в 0,5-3,0 литровых флаконах (бутылях) на роллерной установке. Внесение сыворотки крови крупного рогатого скота менее 12 ведет к резкому снижению репродуктивных способностей клеток, что соответственно приведет к снижению титра вируса, а значит, в итоге, и эффективности самой вакцины. Внесение сыворотки крови крупного рогатого скота более 16 не дает значительного эффекта в репродуктивной способности клеток, а в итоге ведет к удорожанию вакцины. Клетки выращивают в течение 24-48 часов до образования не менее чем 80-90 сплошного монослоя во флаконах (бутылях). Затем проводят замену ростовой питательной среды на поддерживающую, состоящую из 5 -ного гемогидролизата и 2-5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Одновременно с питательной средой вносится аттенуированный вакцинный штамм КМИЭВ-12 в дозе 1-5 вирусных частиц на клетку и культивируют на роллерной установке в течение 144-192 часов при частоте вращения флаконов (бутылей) 8-10 оборотов/час, температуре 370,5 С, величине рН 7,2-7,4 до проявления цитопатического эффекта не менее, чем у 70 клеточного монослоя. Снижение вносимой заражающей дозы вируса менее 1 вирусной частицы на клетку ведет к увеличению времени культивирования вируса, а следовательно и к удорожанию вакцины. Увеличение заражающей дозы более 5 вирусных частиц на клетку ведет к значительному перерасходу посевного материала без соответствующего увеличения иммуногенных возможностей вакцины. После этого флаконы (бутыли) промораживают при температуре минус 20 С в течение суток, затем оттаивают и сливают вирусные сборы в общую емкость. В полученный вируссодержащий материал, стерильный в отношении бактериальной и грибковой микрофлоры, с инфекционной активностью не менее 4,0 ТЦД 50/см 3 добавляют среду высушивания, состоящую из 7,5 сахарозы, 1,5 желатина, 0,2 микробиологического агара в соотношении 31 (3 части вируссодержащей жидкости и 1 часть среды высушивания). Увеличение процентного соотношения компонентов среды высушивания хотя и улучшает сохранность вируса, но ведет к относительно незначительному ухудшению применения вакцины из-за снижения способности к ресуспензированию, вплоть до полной невозможности к растворению. Уменьшение их процентного соотношения незначительно снижает сохранность вируса, а следовательно снижает эффективность вакцины и уменьшает ее срок годности. Полученную смесь тщательно перемешивают, расфасовыва 4 9666 1 2007.08.30 ют во флаконы (ампулы), замораживают при температуре минус 40 С и ниже в течение 810 часов, затем создают вакуум до остаточного давления 50 Па. Время сублимации 10 часов при температуре греющей полки 20 С. Досушивают при температуре 18-20 С в течение 10-12 часов. Остаточная влажность 1-3 . Иммуногенность готовой вакцины проверяют на серонегативных щенках восприимчивых животных 2-6 месячного возраста. Вакцинированные звери приобретают устойчивость к контрольному заражению эпизоотическим штаммом вируса чумы плотоядных. Соблюдение указанных параметров технологического цикла способа производства вакцины обеспечивает получение качественного препарата защищающего восприимчивых животных от заболевания чумой. Таким образом, заявленное изобретение позволяет сконструировать высокоиммуногенную, предназначенную для широкого круга восприимчивых животных и простую в применении вакцину за счет того, что вспособе ее производства используется высокоиммуногенный, глубоко аттенуированный штамм КМИЭВ-12 вируса чумы плотоядных, для культивирования которого использована новая питательная среда для культур клеток 5 -ный гемогидролизат. Подобранные в оптимальных соотношениях стабилизирующие компоненты среды высушивания обеспечивают высокую сохранность и стабильность вакцины. Предлагаемая культуральная вирусвакцина против чумы плотоядных животных и способ ее получения основаны на использовании компонентов отечественного производства,достаточно проста в производстве, что делает ее гораздо дешевле, чем в прототипе. Источники информации 1. А.с. 1287592, , МПК 412 7/00, А 61 К 39/12. - Опубл. 26.06.84 // Бюл.15. 2. А.с. 250799. ЧССР МПК А 61 К 39/75. - Опубл. 15.07.88. 3. А.с. 218120 ЧССР МПК А 61 К 39/175. - Опубл. 15.02.1985 (прототип). 4. А.с. 1287592 , МПК 412 7/00. - Опубл. 26.06.84 // Бюл.15. 5. А.с. 250799 ЧССР МПК А 61 К 39/75. - Опубл. 15.07.88. 6. А.с. 218120 ЧССР МПК 61 39/175. - Опубл. 15.02.85 (прототип). 7. Фармакопейная статья 42-46 ВС-87. - С. 87. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5