Средство для ингибирования размножения вируса лимфоцитарного хориоменингита и вируса Ласса

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА И ВИРУСА ЛАССА(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Богданова Наталья Леонидовна Рустамова Лариса Михайловна Петкевич Александр Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Применение препарата Малавит для ингибирования размножения аренавируса, выбранного из вируса лимфоцитарного хориоменингита и вируса Ласа, в культуре клеток. Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для подавления размножения вирусов лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ) и Ласса в культуре клеток. Разработки способов лечения эффективных химио- и других препаратов для терапии и профилактики инфекций, вызванных РНК-ми вирусами ЛХМ и Ласса (семейство), практически отсутствуют 1. Заболевания, вызванные этими вирусами, высококонтагиозны (передаются воздушнокапельным путем), протекают на фоне высокой температуры, сопровождаются развитием менингита, менингоэнцефалита, может сопутствовать артрит, миокардит и др., относятся к малым иммунодефицитам. Заболевание, вызываемое вирусом Ласса, кроме того, отличается высокой летальностью, до 70 . Инфекции, вызываемые вирусом ЛХМ, регистрируются на территории Республики Беларусь. Источником и резервуаром инфекций ЛХМ и Ласса являются мыши 2-4. Наиболее близким по достигаемому результату является способ лечения геморрагических лихорадок, вызываемых вирусами ЛХМ и Ласса, включающий введение лекарственного средства рибавирина, отечественным аналогом которого является рибамидил 5-6. Однако недостатком известного способа лечения является то, что препарат рибамидил является высокотоксичным. При применении препарата возможны боли в желудке, метеоризм, повышение уровня непрямого билирубина в крови, развитие катаральных явлений желудочно-кишечного тракта. В живых организмах он вызывает подавление иммунитета,11653 1 2009.02.28 вследствие чего, в частности, развивается хронический кандидоз. Наиболее частым побочным эффектом является гемолитическая анемия. Иногда возникают симптомы аутоиммунных заболеваний, артериальная гипотензия, лейкопения и тромбоцитопения. Возможно тератогенное и эмбриотоксическое действие, уменьшение выработки и содержания тириотропного гормона, что ведет к нарушению функции щитовидной железы. Его применение у пациентов до 18 лет не рекомендуется 7, 8. Кроме того, существует особый спектр противопоказаний по применению рибамидила острые заболевания печени (в том числе декомпенсированный цирроз, аутоиммунный гепатит) и почек, первичный гипертиреоз и не поддающиеся лечению заболевания щитовидной железы, беременность, лактация, хроническая сердечная недостаточность Бстепени, инфаркт миокарда, анемия, а также тяжелая депрессия. Задачей, которую решает данное изобретение, является разработка новых способов лечения, эффективных в отношении вируса ЛХМ и Ласса. Результат достигается применением препарата Малавит для ингибирования размножения аренавируса, выбранного из вируса лимфоцитарного хориоменингита и вируса Ласа, в культуре клеток . Малавит 9 - продукт синтеза достижений биоинформационной медицины, классической фармакологии и гомеопатии, приготовлен из экологически чистого сырья Алтая. В его состав входят активные комплексы меди и серебра, минерал малахит и др. кислоты молочная и др., муравьиный спирт, сахар (свекловичный, молочный) ионы серебра, кальция, калия, лития и др. мумие традиционное и мумие белое (каменное масло) ладан, камедь лиственницы, камедь и смола кедра почки березы и сосны, кора дуба экстракты корней и трав Алтайского региона (пион уклоняющийся, тысячелистник, шалфей лекарственный, бессмертник, мята перечная, календула, ромашка аптечная, аир болотный, чабрец гомеопатические препараты аконит и бриония и др. - всего 37 компонентов) на структурированной родниковой воде с низким содержанием спирта без консервантов и красителей. Препарат Малавит применяется для подавления роста синегнойной, кишечной и дифтерийной палочек, золотистого стафилококка, стрептококка А и В, цитобактера, сальмонелл, шигелл дизентерии, грибов рода кандида обладает вирулицидным действием в отношении вируса простого герпеса 1-го типа, вируса Коксаки ВЗ, везикулярного стоматита гриппа, в т.ч. при укусах энцефалитных клещей в качестве средства для наружного применения. Предложенное решение является новым, так как до сих пор не описан способ лечения препаратом Малавит с помощью инъекций. Сущность изобретения поясняется следующими примерами. Пример 1. Токсичность исследуемого препарата изучали на культуре клеток , выращенных на дне флаконов объемом 10 мл. Разведения Малавита готовили на среде Д/МЕМ с добавлением 2 эмбриональной телячьей сыворотки в разведении 10-1, 10-2, 10-3 и 10-4, а также исследовали цельный раствор препарата. Приготовленные разведения Малавита в объеме 1 мл вносили на отмытый от ростовой среды клеточный монослой. Цитопатическое действие препарата на культуру клеток оценивали через 96 ч по 4-х крестовой системе при микроскопировании (увеличение 70 х). Максимально переносимой концентрацией (МПК) считалиразведения препарата, при которой не было обнаружено цитодеструктивных изменений клеток. Таким образом, было установлено, что МПК исследуемого препарата составляет 10-1. Пример 2. Двухсуточную культуру клетокзаражали вирусом Ласса с множественностью инфекции 0,1-0,01 бляшкообразующих единиц на клетку (БОЕ/кл.). После адсорбции вируса на культуре клеток вносили вышеописанный препарат в разведениях 10-1, 10-2 и 10-3. 2 11653 1 2009.02.28 После 72-часовой инкубации отбирали пробы и определяли инфекционную активность вируса методом редукции бляшек под агарозным покрытием 10, 11. Контролем служили культуры клеток, зараженные вирусом Ласса в аналогичных условиях, но без препарата в культуральной среде. Результат оценивали по значению химиотерапевтического индекса (ХТИ), который равен отношению МПК к минимально активной концентрации (МАК), эффект которой находится в диапазоне 1,5-1,7 подавления размножения вируса. Установлено, что препарат Малавит обладает выраженным ингибирующим действием в отношении аренавирусов ЛХМ и Ласса (табл. 1). Как видно из табл. 1, при применении препарата Малавит наблюдается полное подавление размножения вируса в разведениях 10-1, 10-2, в разведении 10-3 снижение инфекционного титра составило 4,8(вирус Ласса) и 4,3(вирус ЛХМ). Таким образом,максимально активное разведение препарата - 10-1, а минимально активное - 10-3. ХТИ препарата Малавит равен 100. В то же время, прототип имеет ХТИ, равный 8. Таблица 1 Ингибирование размножения вирусов ЛХМ и Ласса в присутствии препарата Малавит в культуре клетокТитр вирусаСнижение титра виХТИ Доза) Препарат БОЕ/кл русаБОЕ/кл МПК/МАК препарата ЛХМ Ласса ЛХМ Ласса ЛХМ Ласса Вирус 0 5,7 6,0 ВирусРибамидил 200 мкг/мл 2,2 2,3 3,5 3,7 100 мкг/мл 3,3 3,2 2,4 2,8 8 8 50 мкг/мл 4,0 4,1 1,7 1,9 25 мкг/мл 4,2 4,5 1,5 1,5 12,5 мкг/мл 5,5 5,9 0,2 0,1 ВирусМалавит 10-1 0 0 5,7 6,0-2 10 0 0 5,7 6,0 100 100 10-3 1,4 1,2 4,3 4,8 10-4 5,3 5,3 0,5 0,7 Примечание ) БОЕ/мл - бляшкообразующие единицы. Пример 3. Исследования препаратов в экспериментахбыли выполнены на беспородных белых мышах массой 8-10 г. Животных заражали интрацеребрально в дозе 1000 БОЕ/мышь, что составляло 10 50, в объеме 0,03 мл. Это обеспечивало 100 гибель контрольных животных. Препарат разводили на бидистиллированной воде и в разведении 10-2 вводили по схеме за 24 ч, затем за 1 ч до заражения, далее через 24, 48, 72, 96 ч и 5-8 сутки после заражения. Противовирусную активность препарата оценивали по увеличению выживаемости животных, средней продолжительности жизни (СПЖ), удлинению срока жизни (УСЖ) по сравнению с контрольной группой, которая не получала препарат. В результате проведенных испытаний было установлено, что исследуемый препарат защищал от гибели животных при инфекции Ласса на 57 , а ЛХМ-инфекции - на 60 СПЖ составляла 12,5 дней (вирус Ласса) и 12 дней (вирус ЛХМ) УСЖ было 4,5 суток(вирус Ласса) и 4,0 суток (вирус ЛХМ) по сравнению с контролем инфицированных животных, не получавших лечения. При применении рибамидила в концентрации 50 мг/кг по той же схеме выживаемость мышей при инфекции Ласса составляла 35 , инфекции ЛХМ - 33 СПЖ - 9,5 дней при инфекции Ласса и 9,0 дней при инфекции ЛХМ, УСЖ - 1,5 дня при инфекции вируса Ласса и 1,0 дня - при ЛХМ по сравнению с контрольными животными, не получавшими рибамидил (табл. 2). 3 11653 1 2009.02.28 Таблица 2 Влияние препаратов на выживаемость белых беспородных мышей,зараженных вирусами ЛХМ и Ласса СмертВирус Препарат Защита,СПЖ (сутки) УСЖ (сутки) ность,Ласса Контроль вируса 100 7,0 ВирусРибамидил 65 35 8,5 1,5 ВирусМалавит 43 57 11,5 4,5 ЛХМ Контроль вируса 100 8,0 ВирусРибамидил 67 33 9,0 1,0 ВирусМалавит 40 60 12,0 4,0 Таким образом, противовирусная активность предложенного препарата значительно превосходит таковую рибамидила. Источники информации 1.,,.,.// . - 1974. -4. . 207-213. 2. Букринская А.Г. Вирусология. - . Медицина, 1986. - С. 302-307. 3., // . . . . - 1992. - . 116. - . 486-488. 4.,.,... . . - , 1990. - . 70-114. 5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков Торсинг, 1998. Т. 2. - С. 359360. 6.,Р.В.,С.Т.,.... , 1987. - . 47-51. 7. Зудин Б.И., Сабынин В.М., Богданова Н.Л., Капитулец С.П., Рустамова Л.М., Петкевич А.С. Влияние химио- и иммуномодулирующих препаратов на экспериментальный лимфоцитарный хориоменингит. Современные проблемы инфекционной патологии человека. Эпидемиология, клиника, микробиология, вирусология и иммунология. - Мн., 1998. С. 580. 8.,,.-, -./ . . -, 1980. . 4. - . 170-174. 9. Аннотация по применению Малавита. Сертификат соответствияРОСС.АЕ 96.В 00010 от 27.08.2003 гигиенический сертификат департамента ГСЭС МЗ РФ 77.99.17 915.Д.002649.05.01 от 17.05.2001. 10.,// . - 1960. - 10. - . 233-244. 11. Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зазеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. - М., 1974. - С. 123-129. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4