Способ получения мутантной протеазы

30 до ТГСАСАО АМА СТССАТАСА 0 СГГАТГРССАСГСАТССАБАС 1. Т О 5 О Ч К Ч А Ч Е. В Т С 1 5 Т Н Р ВТО ВО ПСОСАТСССАСССАТЩССЮСОАССАПСГОСПТАААСМТТССАТТООСЕЕТГСП С Н С Т Н Ч А С Т 1 А А Ь Н Н 5 1 С Ч 121.0 220 АССАС АТАСССАСШТСААССТАТОССАОГТАМСОГГАСАТССАТЕССТ АСТССТСАТ З Т Т Р С 5 Т 1 А 5 1 Н С Т 5 И А Т Р Нклонирование гена в вектор экспрессии. трансформацию полученными рекомбинантными ДНК штаммов-реципиентов Васшиз,отбор клопов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, с заменой амино кислот в положениях 32, и/илн 33 и/или 48 и/или 49 и/или 50 и/или 51 и/нли 52 и/илн 53 и/или 54, и/или 58 и/или 59-62 и/или 94107 и/нли 116-118 и/или 123-134 и/или 150 и/или 152-156 и/или 158-161 и/нли 164 и/или 166 и/или 169 и/нли 175-186 и/или 197и/или 198 и/или 203-216 и/или 235 и/или 243 и/или 259 на более устойчивую к окислению нейтральную или анионную аминокислоту.2. Способ по п.1 отличающийся тем, что в качестве штамма-реципиента используют ВасШиз зпЬгййз ДВ 1 О 4.3. Способ по п.1 отличающийся тем, что в качестве штамма-реципиента используют штамм Васшцв, который неспособен продуцировать неклеточные протеазы.4. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в 116 положении неполярную алифатическую аминокислоту с более высокой мол. массой, чем у глицина.5. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 128 вместо серина другую негидроксилированную аминокислоту.б. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 216 вместо метионина любую другую серонесодержащую аминокислоту.8. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 169 любую неполярную алифатическую аминокислоту.9. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в 116 положении вместо глицина валин, или изолейцин, или лейцин.10. Способ по п.1 отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу со следу ющими заменами аминокислотт хнваивац ЬГд ТО ЛИГЕНастоящее изобретение относится к новым протеолитическимфВРМЕНТЗМ С УЛУЧПВННЫМН СВОЙСТВЭМИ, ПрЕДНЯЗНЯЧВНЪЫЦ ДЛЯ приме нения в моющих средствах (детергентах). Эти свойства включаютУЛУЧШЕННУЮ СПОСОбНОСТЬ КОМПОЗИЦИИ К Удалению ПЯТЭН при стиркеВ прачечных, улучшенную стабильность при хранении с детергента МИ ДЛЯ СТИОКИ В прачечных, а также УЛУЧШЭННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ВИспользование ферментативных добавок, в частности, протеолитических ферментов в моющих композициях, позволяющих удалять загрязнения на основе белков, достаточно известно.Стиральные моющие средства, как правило, подразделяют на два основнх типа жидкие и порошкообразные. Жидкие стиральные детергенты содержат в большой концентрации поверхностно-актив нне вещества, имеют нейтральное или умеренное щелочное зна чение рН и обычно не содержат отбеливателей. Порошкообразные детергенты по большей части обладают высокой щелочностью (рН 9-11), в их состав входит пассиваторы, такие как триполи фосфат натрия и в зависимости от принятой практики стирки, в тех странах, где они продаются, могут содержать или не содержать отбеливатели.Потеолитические ферменты, как правило, с трудом совмещаются с моюими композициями. Ферменты должн быть устойчивы и активн в ходе их применения, например, при удалении белковых пятен в ходе стирки при температуре в интервале от 10 С до выше б 0 С. Нроме того он должны сохранять стабильность в течение продолжительнх периодов времени при их хранении в моющем продукте. Соответственно, ферменты должны быть стабильн и фунциональн в присутствии пассиваторов поверхностно-активнх веществ, высокой щелочности, а в некоторых случаях и в присутствии отбеливателей а также повышенной температуры. Поскольку не существует универсальных стиральных детергентов. как не существует унверсальных условий стирки (рН, температура, концентрация раствора, жесткость воды) по всему миру, требования к ферментам могутМЕНЯТЬСЯ В ЗЗВИСИМОСТИ ОТ ГИПЗ ДЭТВрГЭНТЭ, В КОТОРОМ ИХ ИСПОЛЬЗУЮТа также от условий стирки.Один из способов решеня проблемы, связанной с устойчивостью ферментов в моющих составах заключается в подборе организмов или микроорганизмов, проявляющих желаемую ферментивную активность,выделении и очистке фермента из Смикро)организма или жидкой части культуры (микро)органзма, определении биохимических свойств фермента и проверки того, будут ли эти биохимические свойства отвечать требованиям использования. При невозможности получения фермен та из продуцирующего его организма может быть применена технология генной инженерии с выделением гена, кодирующего фермент, зкспресси ей гена в другом организме, выделением и очисткой зкспрессированно го фермента и его испытанием на возможность применения в намеченной области.Другой способ получения новых ферментов, предназначенных для применения в намеченной области, заключается в модификации существующих ферментов.Более специфичным способом получения модифицированных ферментов является сайт-направленнй мутагенез, позволяющий проводить специфичное замещение одной или нескольких аминокислот любой другой целевой аминокислотойС помощью способов случайного и сайт-направленного мутагене за были получен модифицированные ферменты из сериновой протеазы,Вас 111 из атц 1111 дЦеГас 1 епз , также называемой ВРГ 1 субтизисиноц / 1 /. Однако нм для одной из модифицированных протеаз не показана промшленная ценность и превосходство над применяемыми в настоящее время ферментами в соответствующих условиях использо ВЗЪШЯ .