Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных Bacillus-продуцент сериновой протеазы

Производство промышленных сериновых протеаз в различных видах ЕЕЩЦЩ описано,например, в патентах США М 91 Ч 9 3, 674, 643 3, 723, 250 и 4, 480, 043. Производство высокощелочното протеолитического фермента в штампах Зашита способных к росту при Щелочном рН описано, например, в патентах США Ы 9 Ы 9 3, 723, 250 Не 30, бО 2 и 4, 480,037. В качестве обзорной статьи по использованию бацилл для производства промышленно важных ферментов может служить, например,статья Дебабова ТЬе шашни Иве оГ Васйш,ш Т 11 е Мо 1 есв 1 аг В 1 оЬо 5 у от Вас 1111, (Асас 1. Ргеввдеиг Чего, 1982. Протокол трансформации протопласта ВвЦЬйНв был описан в статье Спал апо болел (Моъвегьбепет 168 (1979) 111-115). Подобные протоколы были описаны для успешной трансформации протопластов Вшеяатепцш (Уогощеуа ет.а 1. РВМ Мйсгоыо Ьеттегз 70980) 261-263, протопластов Вашушнциегасйепз (Бшш е а 1., Арр 1. апс 1 Епу. М 1 сгоЪ 3 о 1, 51(1986)6 З 4) протопластов В/(Ьвппвйепзйз (Рйзпег е 1. а 1., Агс 11 М 1 сгоЬ 1 о 1 139 (1981) 213-217, протопластов Вврпаегйсцз(Мс Вопаш, 1.Сгеп. Мйсгоьйо 130 (1984)203) и протопласгов В.1 агтае (Башне ет а 1., Арр 1 апб Епу М 1 сгоЬ 1 о 1 49 (1985) 577). Однако,ваше е 1 а 1. (выше) сообщали о неудачных результатах с Вроршае. Мало ет а 1., Спггеш Мйсгоьто 13 (1986) 131-135 сообщили об успешной трансформации В.ро 1 ушуха,Вмспепйогшгз, В.шасегап и В.1 агегоро 1 и 5. Однако, эти способы не были удачными в случае Всоадшапз, Всегеоз и Врвшйив, хотя и наблюдалось хорошее образование протопластов. Другие способы введения ДНК в протопласты включают слияние с липосомами содержащими ДНК (НоШЬоуа, Рона Мйсгоыо 30 (1985 97).Выделение и экспрессия генов высокощелочной протеазы раскрываются в приоритетном документе Европейской заявке Ы ЕР-А 8720 О 358,7, на котором основана данная заявка, содержание которой включено здесь с помощью ссылок.Удобный вектор для трансформации клетки ВасШцз включает структурный ген, кодируюший высокошелочную протеазу, получаемый щелочефильной ВасЩцз, содержащей коитродшруюшие районы, такие как последовательность промотора, последовательность, образующая участок связываьшя с рибосомами, и последовательности, контротшруюшие тершшашпо транскритппш и трансляции гена щелочной протеазы,причем перечисленные контролирующие участки являются функциональными в хозяйской клетке шелочефильной Вас 111115.Кроме того вектор может содержать маркерный ген, например, для придания устойчивости к антибиотику, к которому хозяйский штамм чувствителен (особый интерес представляет устойчивость к неомицину), и ог 151 п репликации, который способен автономно реплицироваться в хозяйской клетке. Огйзйп репликации может и быть таким, который имеет мутацию, делающую его функционирование в хозяйской клетке температуре-чувствительным, таким образом, обеспечивая селекцию на хромосомальное встраивание как описано Е 11 г 11 с 11 Ргос, ЫатЬАсаа. 5 с 1 ПЗА 75 (1978) 1433.С Целью производства высокощелочной протеазы предпочтительной последовательностью ДНК для использования в трансформации штаммов ВасШЦз, которые уже продуцируют сериновую протеазу, является последовательность, полученная из Васшив поттовресйез РВ 92. Аминокислотная последовательность сериновой протеазы, кодируемая указанной последовательностью ДНК, следующаяХотя предпочтительным штаммов для обеспечения гена протеазы является вид ВасШш РВ 92, по существу, такая же сериновая протеаза и может быть получена из других щелочефнльных бацилл. Гены протеаз,гомологичные, по крайней мере, на 70 и,предпочтительно, свыше 80 гену ВасШив РВ 92, входят в объем настоящего изобретения.Желательно, чтобы продукт эксперссии секретировался. Так как Щелочная протеаза секретируется, могут быть использованы секреционные лидерные сигналы и сигналы процессинга дикого типа. Кроме того, может быть получен влитый ген путем придания 5 последовательности структурному гену, кодирУЮЩему Секреторный лидерный сигнал и ситнал процессинга. Характерные гетерологичные секреторные лидерные последовательности включают секреторные лидерные последовательности генов амилазы и протеазы Внешне. В зависимости от того, желательно ли встраивание структурального гена в хромосому хозяйского штамма, либо поддержание его во внехромосомальном элементе, репликацион 5 ВУ 1224 С 1 вная система вшддд может быть включена или Нет. С целью встраивания участка гомологии плазмидной конструкции с геном Вацшш могут быть использованы для увеличения вероятности рекомбинации. Более того, включение в плазмидную конструкцию температуре-чувствительного огйрйп репликации позволяет проводить селекцию по хромосомальному встраиванию (См., например, ЕЬгНсЬ,Ргос.11 ат 1.Асас 1.сй.П 5 А 75(1973 1433). ДЛЯ увеличения экспрессии структурного гена в хозяйскую клетку может быть вставлено более одной копии структурного гена. Стабильная амплификация структурного гена может быть получена встраиванием, по крайней мере, одной добавочной копии структурного гена с геном хозяйской клетки и отбором трансформантов, в которых копии структурного гена разделены Эндогенными хромосомальными последовательностями. Конструкции ДНК и способы для прокариотических систем описаны в Европейской заявке Не ЕР-А 87200356 изобретение, которое включено здесь в качестве ссылки.В качестве хозяина для трансформации может быть использован любой штамм Ьшлшш,однако при выборе подходящего штамма учитываются факторы, которые могут улучшить продукцию высокошелочных протеаз. Продукция может быть улучшена различными путями, включая хозяина, в котором снижена деградация желаемого продукта, узнавание регуляторных сигналов, облегчение секреции и так далее. Таким образом, хотя предпочтительным хозяином Васшиз является продуцент высокощелочной протеазы, в качестве хозяина также может быть использован мутант, который сам по себе не вырабатывает высокощелочную протеазу.Бациллы, продуцирующие высокощелочную протеазу, таксономически недостаточно классифицированы и их обычно относят к щелочефильным штаммам Вашим. Примеры штаммов Барды способных расти при щелочном рН описаны, например, в патентах США Мот З, 723, 250 Не 30, 602 и 4, 480, 037. Примером предпочтительного хозяйскогоштамма Щелочефильного ЩЦЦЩ является штаммРВ 91 раскрытыйПромышленные штаммы щелочефильных Башни могут также быть использованы в качестве хозяйских клеток. Для промышленных штаммов Дадшцд характерна устойчивость к генетическому обмену, такому как фаговая инфекция или трансформация. Эти штаммы стабильны и трансформанты могут быть или не быть способными к образованию спор. Они обычно фототрофы и модифицированы для обеспечения высоких выходов эндогенных бел 10ковых продуктов, таких как альамилаза и различные протеазы. Выход эндогенного белкового продукта, полученный в процессе промышленного производства, может доходить, по крайней мере, до 5 г/л 0,5 (объем/вес). Промышленные штаммы такие секретируют ДНК-азы, которые приводят к деградации ДНК в среде, обеспечивая защиту от генетического обмена.Трансформация Щелочефильнътх штаммов 339111115 будет преимущественно включать использование протопластов упомянутых штаммов. Однако, как описано СоЬеп ет а 1 (выше) обычный способ трансформации протопласта не работает для щелочефильных штаммов Васшиз. Следовательно должны быть разработаны Дополнительные способы.Для Щелочефильных бацилл образование и регенерация протопластов может происходить при высоком рН, предпочтительно около рН 8. Протопласты могут быть приготовлены ресуспендированием клеток в щелочной буферной среде (АНМ - а 1 ка 11 пе Пошл ЩесНиш рН 7,885 с последующей инкубацией в течение 30-80 минут при 37 С. В качестве примера АНМ смотри Пример 5. Полученные протопласты затем промываются для удаления лизоцима,затем ресуспендируются в АНМ. Затем, в присутствии подходящею реагента для сглазшия,плазмидная конструкция и протопласг щелочефильного хозяина ВасйЦпз объединяются. Хотя может быть использован любой реагент для сливания, который обеспечивает желаемую эффективность, обнаружено, что полшэтиленгликоль молекул веса 1000-8000 в значительной мере обеспечивает высокую эффективность слияния. Протоплаегы, приготовленные из акцепторного штамма ВасШпв смешиваются с плазмидной конструкцией в течение не более 5 шанут, желательно не дольше 2 минут в присутствии полиэтилех-пшхоля. Смесь реагентов для слияния затем меняется обычной питательной средой, в которой клетки инкубируются в течение до 5 часов, предпочтительно 2-3 часов, перед переносом на регенерирующие чашки. Регенерирующие чашки содержат антибиотик, такой, как неомицин для отбора трансформантов.Клоны с эписомштыаъш полдержггваштем конструкции ДНК могут быть идентифицированы путем обнаружатся эксперсони высокощелочной сериновой протеазы. Для индентифшсацш тех кленов, которые содержат экспрессирующую конструкцию в виде участка, встроенного в их хромосомы, клены, которые получаются. скринируются путем выделеъшя цилиарной клеточной ДНК и отбора кланов, в которых может быть обнаружена свободная щазмидная ДНК,но маркерный ген плазмиды экспресспруется. Эти клопы затем можно скринировать подхо 7 ВТ 1224 С 1 здящими способами, для обнаружения экспрессии высокошелочной сериновой протеазы.Различные методы обнаружения, включая использования специфических антител, ДНК или РНК пабридизацию, образование ферментного продукта или использование ферментного субстрата, могут быть использованы для скринирования кленов с целью обнаружения присутствия экспрессирующей конструкции и экспрессии интересующего структурного гена,а именно производства протеазы. Производимая протеаза может быть охарактеризована биохимически, например, определением молекулярного веса протеазы с помощью электрофореза в 135 чюлиакриламидном геле,электрофореза в гис-тидшт-МОРБ геле и определением кинетических параметров Кш и Уши определяемых на синтетическом субстрате зцес 1 пу 1-аапу 1-Ь-а 1 апу 1-1.-рго 1 у 1-1.р 11 епу 1 а 1 апу 1-р-пйтго-апайс 1 е.Хозяин ВасШпз, содержащий экспрессирующую конструкцию, включенную эписомалъно или хромосомально, затем выращивается на питательной среде в условиях, благоприятствующих синтезу фермента. Питательная среда обычно будет включать средства для поддержания плазмиды, такие как присутствие антибиотика, к которому чувствителен нетрансфорьшрованный хозяин, ферментация может продолжаться пока не истощится бульон. Там, где продукт секретируется, он может быть выделен из бульона удобным способом,например, экстракцией, хроматографией,электрофорезом или подобным. Там где продукт остается в цитоплазме, клетки могут быть собраны центрифугированием, фильтрацией и так далее, лизированы механическим перетированием, детергентом, лизоцимом или други ми методами и продукт может быть выделен,как описано ранее.Когда нетрансформированная хозяйская клетка является продуцентом высокощелочной протеазы, посредством представленного метода могут быть достигнуты сильно увеличенные выходы высокощелочной сериновой протеазы,обычно, по крайней мере, 120 по сравнению с выходом в нетрансформированной хозяйской клетке с единственной внехромосомной копией гена.Рисунок 1 показывает результаты гистидин/МОРЗ гельэлектрофореза проведенного с суспернатантами культурВВ 104, содержащими соответственно рИВ 110 И рМ 58,в сравнении с некоторыми субтилизинами.2 дорожка протеаза ВасШиз РВ 925 дорожка ВасШиз зцЬййз ЦВ 104 (рНВ 110).Рисунок 2 показывает рестрикционную карту плазмиды рМ 58. Более того, в верхней части рисунка показана стратегия секвенирования. Сплошные линии со стрелками представляют фрагменты, клонированные в векторах шр 10, шр 11 и шр 13 фага М 13. Нижняя часть рисунка показывает стратегию сиквенирования с использованием 10 олигонуклейтидов, локализованных через равные промежутки на гене протеазы.Рисунок 3 показывает нуклеитидную последовательность кодирующей цепи, соотнесенную с аминокислотой последовательностью сериновой протеазы Барды РВ 92. Также показаны промоторы (Р 1 Р 2) сайт связывания рибосом (гЬз) И районы терминации (теги) последовательности ДНК. Пронумерованные сплошные линии представляют место размещения десяти олигонуклеитидов, использованных для секвенирования.Рисунок 4 А показывает конструирование плазмиды рЕ 194 пео.Рисунок 4 В показывает конструирование плазмИдЫ рМАХ-4Изобретение иллюстрируется следующими примерами.Приготовление библиотеки геномной ДНК из щелочефильного нового вида Васшпз РВ 92 и выделение гена сериновой протеазыГромосомальная ДНК, выделенная из Васшиз поуо зр. РВ 9-2 (хранится под Не 011-60 в лаборатории микробиологии, Технический университет Дельфта, Нидерланды, смотри патент США Не Не 30, 602) по способу, описанному БаНо-Мйпуа, В 1 осп 1 ш.В 1 ор 11 у 5.Аста. 720963) 619-632, и была частично переварена рестрикционным ферментом Зап ЗА и лигирована в ВашН 1 сайт плазмиды рИВ 110(Огусаап ет а 1., У.Вастег 1 о 1 134 (1978) 313-329). Плазмида ДНК рИВ 110 была приготовлена как описано В 1 гпоЬо 1 ш и Во 1 у (Ыцс 1 Ас 1 с 1 з Кев,70979) 1513-1523).Лигирующую смесь трансформировали в Вдвойне 1 А 40. Генетический центр хранения бацилл по способу Бршзепет а 1., Жвастегйо 81(1961) 741-746, используя 0,б-1 мкг ДНК на мл компетентных клеток. Клетки из трансформационной смеси высеивали на минимальные чашки, содержащие 2,8 Х, К 2 НРО 4 1,2 И,КН 2 РО 4 0,4 Х, (ЫН 4)2 504 0,2 три-Нацитрат. 2 Н 2 О 0,04 И, М 5 О 47 Н 2 О 0,00005 Мп 5 О 44 Н 20 0,4 К, 1. чшутаминовую кислоту 0,5 И, глюкозу 0,02 И, казаминовых кислот 50 мкг/мл триптофана 20 мкг/мл метионина 20 мкг/мл лизина 20 мкг/мл неомицина 0,4 И, казеина и 1,5 И, агара. После инкубации чашек в течение ночи при 37 одна из 50000 колоний, устойчивых к неомицину, показала возросшую продукцию про 9 ВТ 1224 С 1теазы, что определили по увеличению преципитации ореола продуктов расщепления казеина вокруг колоний на пластинке агара. Плазмидная ДНК была выделена из этой колонии по способу, описанному вйгпЬойш и ВоЪу, Ыцс 1 ейе Асйбз Кез. 7 (1979) 1513-1523 и обозначена рМ 58.Экспрессия деда сериновои протеазы ЕВ 92 Вастцв вцътпгз 1 А 40, содержащая рМ 58 была выращена на минимальной среде (Бршзеп ет 211., Ргос. Ыа 11. Асас 1. 5 с 1. ПЗА. 44 (1958) 10721078), к которой было добавлено 0,02 И, казаминовых кислот 50 мкг/ мл триптофана 2.0 мкг/ мл метионина 20 мкг/мл лизина и 20 мкг/ мл неомицина. Через 24 часа культуру центрифугировали и суспернатант проверяли на протеазную активность используя в качестве субстрата диметилказеин Цпе е а 1., У. В 1 о 1. С 11 еш. 244 (1969) 789-793. Культура вддвдъ 1 А 40, содержащая плазмиду рИВ 110, использованная в качестве контроля, показала меньше 1/ 60 протеазной активности,показанной культурой, трансформированной рМ 58. Протеазная активность полностью ингибировалась обработкой 1 мМ фенилсульфанилфлуоридом (РМ 17), но не 20 мМ ЭДТ.Аликвоты супернатантов, описанных выше,анализировались с помощью белкового геля по способу Ьаешшй, Ыатиге 227 (1970) 680. Пробы для анализа на этих гелях были приготовлены обработкой супернатантов 5 трихлоруксусной кислотой (ТХУ). После центрифугирования образца, осадок препитированного белка промывался дважды ацетоном,затем растворялся в 40 мкл буфера для образцов (0,5 М Трио/НС рН 7,5 10 (объемных) 2-меркаптоэтанола 50 (объемных) глицерина и 0,05 И, бромфенолового синего) при кипячении в течение 10 минут. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси Бриллиантовый Синий. Затем пробы супернатанта культур анализировались электрофорезом. Использовались три разных штамма 1 А 40 штамм, содержатий рИВ 110,или рМ 58 или без плазмиды и протеаза Васшиз РВ 92 в качестве контроля. После электрофореза гели окрашивали используя Кумас си Бриллиантовый Синий и отмывали. Образец из 85111311115 штамма 1 А 40, содержащего рМ 58,содержал белок весом 31 кДа, который мигрирует совместно с протеазой Васшцз РВ 92. Этот белок не обнаруживался в контрольной дорожке штамма 1 А 40, содержащего рИВ 11.Все сериновые протеазы имеют одинаковые молекулярные веса. По этому клонированная сериновая протеаза Зашита РВ 92 дифферцировалась от известных сериновых протеаз субтилизина В. субтилизина Саг 15 Ьег 3 с помощьютрансформации РМ 58 и ИВ 110 в беспротеазный штамм В.зиЬ 11115 ЦВ 104 02.1301. 1.Вастег 1 о 1 160 (1984) 442-444) и анализа продуцируемой внеклеточной протеазы. Полученные трансформанты выращивались на минимальной среде (Брйийвеп ет.а 1 выше), содержащей 0,02 и, казаминовых кислот, 50 мкг/ мл гистидина и 20 мкг/ мл неомицина. Через 24 часа были взяты образцы, центрифугированы и без дополнительной обработки анализирован с помощью гистидин/МОРЕ гелей, содержащих 75 мМ КОН 40 мМ гисгдин 100 мМ МОРЗ (3-(1 1-морфолино) щропансульфоновая кислота), рН 7,5 и 5 полиакриламид. электрофоретический буфер содержал 40 мМ гистидина, 100 мМ МОРБ, рН 6,6. Образцы двигались по направлению к катоду. Полосы протеазы обнаруживались с помощью профессиональных пленок Арго Рап 100.(Ищете ет. а 1 ВйотесЬпо 1 и Ьйоепщп 14 (1972) 685-714). Эти результаты показаны на рисунке 1. Как показано, рМ 58 несет ген, кодирУЮЩий протеазу Вас 111 п 5 РВ 92. Пример 3 в т ы 11 Р Полная последовательность Ва 11 Нра 1 фрагмента рМ 58 была определена способом Бапдег,Ргос. Май. Асас 1, Бей. УЗА 740977-6469. Рестршщионные фрагменты рМ 58 (смотри рисунок 2) были клонированы в векторах Щр 10,шр 11 и шр 18 фага М 13 Меззйпд ет а 1, Ы 1 с 1 е 1 е Асйаз Ке 9 (1981) 309-321). встраивания фрагментов м 58 скринивали с помощью гибридизации бляшек. После секвенирования были сделаны десять олинонуклеотидов, локализованных через равные промежутки на гене и было повторено секвенирование, которое подтвердило последовательность, показанную на рисунке 3. Пример 4 Н И ПДля конструирования плазмиды р ПСЫ 710(рисунок 4 А) рИВ 110 была переварена 1 и Р П. Фрагмент, содержащий ген, придающий устойчивость к неомицину, был очищен с помощью низкоплавкой агарозы и затуплен полимеразой Кленова и НТФ (Маштайв,Мо 1 еси 1 аг С 1 оп 1 пд Афаьогатогу Маппа 1. Со 1 с 1 Зргйпд НагЬог 1982). Плазмида рИС 7 (Иена ет.а 1. Сгепе 19 (1982) 259-268) была лгшеаризована 5 а 1 1 и затуплена, как описано выше. Оба фрагмента были лигированы Т 4 лизазой(Мапйайз) трансформированы в Е.СО 1 УМЮЗ. Отбор вели на 2 хТУ чашках (1,6 И, вес/объем Бакто-триптона 1 вес./ объем дрожжевого экстракта 0,5 ЫаСН, содержащих 50 мкг/ мл ампициллина и 10 мкг/ мл неомицина. Полученная Плазмида, названная рИСЫ 710, х-4