Метод иммунотерапии мультирезистентного туберкулеза легких

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МЕТОД ИММУНОТЕРАПИИ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Титов Леонид Петрович Гончаров Андрей Евгеньевич Скрягина Елена Михайловна Шпаковская Наталья Савельевна Залуцкая Оксана Михайловна Антонова Наталья Петровна Новохатько Тарас Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Способ иммунотерапии мультирезистентного туберкулеза легких, заключающийся в том, что выделяют из периферической крови больного моноциты, получают из них незрелые моноцитарные дендритные клетки, получают лизат аутологичных микобактерий,праймируют им незрелые моноцитарные дендритные клетки, после чего индуцируют созревание моноцитарных дендритных клеток и вводят больному зрелые моноцитарные дендритные клетки, праймированные лизатом аутологичных микобактерий, подкожно трехкратно с интервалом в две-три недели. Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и методам клеточной биотехнологии, и может быть использовано с целью адъювантной специфической иммунотерапии пациентов с мультирезистентным туберкулезом. В соответствии с данными ВОЗ, ежегодно туберкулезом заболевает около 9 млн. человек и более 2 млн. погибает. По данным Министерства здравоохранения в Республике Беларусь доля летальности от туберкулеза составляет 80 от всех инфекций. Развитие и широкое распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью резко ограничило возможности этиотропной полихимиотерапии туберкулеза, переводя его в разряд неизлечимой болезни с тяжелым прогрессирующим течением и высокой летальностью. Так, относительное число больных мультирезистентным туберкулезом составило в 2007 г. в Беларуси 15,9 от числа всех больных туберкулезом. При этом показатель летальности пациентов с мультирезистентным туберкулезом в 2 раза выше, чем у бактериовыделителей без множественной лекарственной устойчивости (7,3 и 16,5 соответственно). 17456 1 2013.08.30 Мультирезистентный туберкулез характеризуется различными нарушениями иммунной системы, что приводит к недостаточно эффективному иммунному ответу, направленному против возбудителя заболевания. В связи с этим требуется разработка нового метода адъювантной иммунотерапии туберкулеза, способного стимулировать формирование мощного специфического иммунного ответа. Известно, что для терапии больных хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями используют дендритные клетки (ДК), полученные из моноцитов 1, 2, 3. Роль ДК состоит в поглощении чужеродного агента, его процессинге и представлению в лимфоидных органах Т-лимфоцитам, что приводит в активации последних. Праймирование ДК соответствующими антигенами позволяет получить антигенспецифические ДК. До настоящего времени не опубликовано результатов клинических испытаний метода лечения туберкулеза с использованием ДК. Задачей изобретения является разработка метода адъювантной иммунотерапии мультирезистентного туберкулеза, который обладал бы преимуществами перед ранее использованными методами. Результат достигается в способе иммунотерапии мультирезистентного туберкулеза легких, заключающемся в том, что выделяют из периферической крови больного моноциты, получают из них незрелые моноцитарные дендритные клетки, получают лизат аутологичных микобактерий, праймируют им незрелые моноцитарные дендритные клетки, после чего индуцируют созревание моноцитарных дендритных клеток и вводят больному зрелые моноцитарные дендритные клетки, праймированные лизатом аутологичных микобактерий, подкожно трехкратно с интервалом в две-три недели. Способ осуществляют следующим образом 1) из периферической крови пациента выделяют моноциты, которые культивируют на бессывороточной среде -, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины ГМ-КСФ и ИЛ-4 для индукции дифференцировки моноцитов в ДК 2) получают лизат штаммов аутологичных микобактерий путем многократного замораживания-оттаивания в жидком азоте 3) ДК праймируют 10 мкг/мл лизата микобактерий на протяжении 6 ч 4) в качестве индуктора созревания моноцитарных ДК используют комбинацию рекомбинантного человеческого фактора некроза опухолей- (ФНО-) и 6,2-дибутириладенозин 3,5-цАМФ (дибутирил цАМФ) 4 5) проводят контроль зрелости ДК путем определения их иммунофенотипа (относительное число ДК в культуре, экспрессирующих молекулу 11 с, не должно быть менее 90 , 86 - менее 80 , а 83 - менее 80 ) 6) проводят контроль на наличие контаминации бактериями и дрожжеподобными грибами путем посева на тиогликолевую среду и среду Сабуро 7) введение ДК осуществляют трехкратно с интервалом в две-три недели 8) клиническими критериями эффективности иммунотерапии являются абациллирование больного, положительная клинико-рентгенологическая динамика, положительная динамика развития специфического Т-клеточного иммунного ответа. Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером. Пример. На основании решения Комиссии по способам профилактики, диагностики, лечения,реабилитации и организационным формам работы Министерства здравоохранения Республики Беларусь (протокол от 17.09.2009) и в соответствии с письмом Министерства здравоохранения Республики Беларусь ( 09-15/836-547 от 22.09.2009) с ноября 2009 г. по сентябрь 2010 г. на базе ГУ РНПЦ пульмонологии и фтизиатрии проведены клинические испытания Способа иммунотерапии больных мультирезистентным туберкулезом с использованием аутологичных моноцитарных дендритных клеток, разработанного совместно специалистами ГУ РНПЦ эпидемиологии и микробиологии и ГУ РНПЦ пуль 2 17456 1 2013.08.30 монологии и фтизиатрии. Протокол клинических испытаний был одобрен Комитетом по этике ГУ РНПЦ пульмонологии и фтизиатрии (протокол заседания 2 от 28.09.2009). Получение культур незрелых ДК. Эксперименты проводили на незрелых мДК, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластиковых культуральных планшетах. Из крови больных мультирезистентным туберкулезом центрифугированием на градиенте плотности фиколл-пака выделяли фракцию мононуклеаров периферической крови (МПК),затем из полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике. Для получения незрелых ДК моноциты культивировали 7 суток в питательной среде-, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4). Получали лизат штаммов аутологичных микобактерий путем многократного замораживания-оттаивания в жидком азоте фильтровали лизат через 0,2 мкм фильтры, тестировали на стерильность и измеряли концентрацию белка. Праймирование и индукция созревания ДК. ДК культивировали на протяжении 6 ч в питательной среде с 10 мкг/мл лизата аутологичных мультирезистентных микобактерий. Затем ДК отмывали от лизата и культивировали в питательной среде, содержащей 25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4, а также ФНО- (50 нг/мл) и дибутирил-цАМФ (500 мкг/мл) в качестве индуктора созревания. Клетки культивировали при 37 С в увлажненной атмосфере с 52 в течение 18 ч. Проводили контроль на наличие контаминации бактериями и дрожжеподобными грибами. Введение ДК осуществляли трехкратно с интервалом в две-три недели. Количество введенных ДК одному пациенту составило 15,8 (12,0-18,7)106. В процессе лечения контролировали общее состояние пациента, бактериовыделение, рентгенологическую динамику, иммунный статус, параметры Т-клеточного специфического иммунного ответа. Результаты. 1. Показана безопасность и эффективность проведенной иммунотерапии. Побочных эффектов в ходе исследования выявлено не было. 2. В результате проведенных клинических испытаний эффективность способа иммунотерапии оценивается как положительная по снижению интенсивности бактериовыделения в 69,2 наблюдений в сравнении с контрольной группой (30,8 ,0,05), более частой положительной рентгенологической динамике (в 69,2 наблюдений и 30,8 соответственно,0,05), увеличению соотношения 4/8, увеличению содержания активированных/регуляторных Т-лимфоцитов Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3