Способ диагностики туберкулеза легких

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение Научноисследовательский институт пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Лобанок Елена Станиславовна Ратникова Татьяна Александровна Василевич Ирина Борисовна Гуревич Геннадий Львович Скрягина Елена Михайловна Егорова Наталья Викторовна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение Научноисследовательский институт пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56)2004130304 , 2005. СКРЯГИНА Е.М. и др. // Проблемы туберкулеза. - 1998. - 4. - С.51-53. БЕЛОВА И.Б. и др. // Медицинская визуализация. - 1999. - октябрь-декабрь. . 7-13. СМУРОВА Т.Ф. // Медицинская помощь. - 2001. - 3. - С.5-9. СОКОЛОВ В.А. // Проблемы туберкулеза. - 2001. - 3. - С. 10-14. Лабораторная диагностика туберкулеза. - Москва, 2001. - С. 14-19, 66-77,125-131, 144-147, 159-161. ШЕМЯКИН В.Л. Клинико-лучевая диагностика туберкулеза органов дыхания Автореферат диссертации. - Москва,1997. - С. 7-9, 18. ЖИВОТОВСКИЙ Б.Г. Дифференциальная диагностика туберкулеза легких. Астрахань, 2000. - С. 6-17.2783 1, 1999.1411618 1, 1988.1163263 , 1985.2077719 1, 1997.56593 , 2003.(57) Способ диагностики туберкулеза легких, отличающийся тем, что получают из стабилизированной антикоагулянтом венозной крови суспензию лимфоцитов (2-4)106 кл/мл,добавляют к ней аминолевулиновую кислоту до концентрации 0,8 мМ, инкубируют при 37 С в течение 1-2 часов, после чего измеряют интенсивность флуоресценции суспензии лимфоцитов при возбуждении флуоресценции светом в области 390-420 нм и, если получают значение отношения максимума флуоресценции при 636 нм к максимуму флуоресценции в области 680-720 нм меньше, чем 2,80,4, диагностируют туберкулез легких. Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано для диагностики туберкулеза легких. Известен способ прижизненной диагностики туберкулеза, включающий выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, сравни 13476 1 2010.08.30 тельную оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции,в качестве индуктора дыхательного взрыва используют опсонизированный зимозан, а в качестве дополнительного индуктора хемилюминесценции используют специфический туберкулезный антиген, дезинтеграцию микобактерий проводят ультразвуком низкой частоты и высокой интенсивности 1. Недостатками известного способа является использование специфического туберкулезного антигена, что не безопасно для медицинского персонала, использование дорогих реактивов (зимозан) и нескольких приборов (хемилюминометр и ультразвуковой дезинтегратор). Известен диагностический способ спектроскопической диагностики туберкулеза 2. Недостатками известного способа является то, что обследуемые пациенты подвергаются болезненной и травмирующей процедуре для получения исследуемого субстрата(плевральный выпот), необходимость проведения спектрального анализа проб в широком диапазоне спектра от 230 до 800 нм, требующего использования только кварцевой кюветы и специальных спектроскопически чистых растворителей (95 этанол, диоксан, тетрагидрофурана), использование стабилизаторов и дорогостоящего кельвинатора для замораживания исследуемых образцов. Задачей изобретения является создание безопасного, высокочувствительного, простого, экспрессного способа диагностики туберкулеза легких. Поставленная задача достигается тем, что в способе диагностики туберкулеза легких,согласно изобретению, из стабилизированной антикоагулянтом венозной крови получают суспензию лимфоцитов (2-4)106 кл/мл, добавляют к ней аминолевулиновую кислоту до концентрации 0,8 мМ и проводят инкубацию при 37 С в течение 1-2 часов. После этого измеряют интенсивность флуоресценции суспензии лимфоцитов при возбуждении флуоресценции светом в области 390-420 нм. Если получают значение отношения максимума флуоресценции при 636 нм к максимуму флуоресценции в области 680-720 нм меньше,чем 2,80,4, диагностируют туберкулез легких. Аминолевулиновая кислота (АЛК) - ранний предшественник гема, промежуточным продуктом синтеза которого являются порфириновые пигменты, флуоресцирующие в красной области спектра (3). Кроме того, известно, что возможно увеличение содержания эндогенных порфиринов в животных клетках и тканях при добавлении к ним экзогенной АЛК. Ткани различного гистологического типа существенно различаются по способности осуществлять АЛК - индуцируемое накопление порфиринов. АЛК - индуцируемое накопление порфириновых пигментов особо выражено при активации клеток, увеличении их пролиферативной активности и злокачественной трансформации. Образование порфиринов в лимфоидных клетках начинается сразу. Спектр флуоресценции порфириновых пигментов в норме в суспензии лимфоцитов периферической крови (ЛПК) имеет два выраженных максимума в области 620-645 нм и 690-720 нм. У больных туберкулезом спектр суспензии ЛПК характеризуется смещением в коротковолновую область спектра и увеличением интенсивности флуоресценции второго пика в области 680-720 нм, интенсивность которого в ЛПК здоровых людей намного меньше. Причина увеличения второго порфиринового пика, вероятно, связана с процессами модификации (окисления) порфириновых пигментов и образования окисленных продуктов со спектральным максимумом в области 680-720 нм в ЛПК больных туберкулезом людей. Подобных спектральных изменений АЛК-индуцируемых порфиринов в ЛПК больных туберкулезом ни при одной из патологий легких ранее не было выявлено. На фигуре изображены типичные спектры флуоресценции, проинкубированных с аминолевулиновой кислотой в течение 1 ч, суспензии лимфоцитов периферической крови больных (1) и не больных (2) туберкулезом легких людей. Флуоресценцию возбуждали в области 390-420 нм. 13476 1 2010.08.30 Экспресс-способ осуществляют следующим образом у обследуемого проводят из вены забор крови в пробирку с антикоагулянтом (например, с гепарином), стандартным методом получают лимфоциты в количестве 2-4106 кл/мл, добавляют к ним АЛК (0,8 мМ),инкубируют в течение 1-2 часов при 37 С и проводят спектроскопический анализ полученных проб в диапазоне от 560 до 720 нм. Затем определяют отношение максимума флуоресценции при 636 нм к максимуму флуоресценции в области 680-720 нм. Статистический анализ, проведенный в группах здоровых и не больных туберкулезом легких людей, показал, что рассчитанный параметр равен 2,80,4. Способ иллюстрируется следующими примерами Пример 1 Здоровый донор К., 40 лет. Кровь получили в ГУ Республиканский научнопрактический центр гематологии и трансфузиологии МЗ РБ г. Минска. Проведен спектроскопический анализ лимфоцитов периферической крови. Затем определяют отношение интенсивности флуоресценции при 636 нм к интенсивности флуоресценции в области 680-720 нм. Полученное значение оказалось равным 2,75, что находится в интервале значений параметра, характерного для практически здоровых людей (2,80,4). Таким образом, обследованный человек не болен туберкулезом легких. Пример 2 Больной М., 77 лет. С 1996 года неоднократно лечился в ГУ НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ, г.Минска по поводу бронхиальной астмы. Последнее стационарное лечение проходил в 2005 году. Ухудшение состояния отмечено с октября 2006 года. Рентгенологически у больного выявлена избыточность деформации легочного рисунка в обоих легких и сгущение его в нижних отделах легких. Поставлен диагноз Бронхиальная астма,смешанная форма, тяжелое течение, фаза обострения заболевания. При спектроскопическом анализе лимфоцитов периферической крови и расчете показателя по предлагаемому способу было установлено, что он равен 2,5. Таким образом, у данного больного не выявлено туберкулеза легких. Пример 3 Больной Д., 68 лет, обратился к врачу с жалобами на слабость, кашель с небольшим количеством слизистой мокроты, потливость, повышенную утомляемость, отдышку при физической нагрузке и повышение температуры тела до 38 С. Больной получил противовоспалительное лечение. При рентгенологическом обследовании выявлены инфильтративные фокусы в язычковых сегментах левого легкого на фоне избыточного деформирующего по ячеистому типу легочного рисунка, которые частично рассосались. Инфильтративные фокусы выявлялись в верхней доле правого легкого (в проекции 3-го межреберья). Затемнен левый синус. Установлен диагноз полисегментарная двусторонняя пневмония в фазе рассасывания. Воспалительные изменения в легких расцениваются как левосторонняя плевропневмония. Рассчитанный по предлагаемому способу показатель оказался равным 2,5, что свидетельствует об отсутствии туберкулеза легких у данного больного. Пример 4 Больной В., 50 лет, инвалид 2-й группы. В марте 2006 года установлен диагноз инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого. М.. Установлена множественная лекарственная устойчивость М.к противотуберкулезным препаратам (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, микобутин,ПАСК). Однако с октября 2006 г. наблюдается положительная динамика несмотря на сохранение изменений в верхней доле правого легкого, инфильтративный фокус в прикорневой зоне слева рассосался. Сопутствующие заболевания ревматоидный артрит,язвенная болезнь желудка. Проведен спектроскопический анализ лимфоцитов периферической крови. Установлено, что величина параметра в 1,7 раз ниже контроля, что свидетельствует о наличии туберкулеза легких у данного больного. 13476 1 2010.08.30 Пример 5 Больной М., 51 год. Впервые туберкулез легких выявлен в 2005 году. С 29.03.2005 г. по 23.12.2005 г. проходил лечение в ГУ НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ г.Минска. В июле 2006 года установлено прогрессирование туберкулезного процесса. Рентгенологичеки определяется интенсивное затемнение с четкими контурами по ходу междолевой щели правого легкого (осумкование жидкости). В проекции нижней доли легкого справа - увеличение интенсивности затемнения за счет инфильтративных и плевритических наслоений (возможно жидкость). Правый купол диафрагмы четко не дифференцируется. Процесс расценен как фиброзно-кавернозный туберкулез правого легкого. М.. Множественная лекарственная устойчивость М.к противотуберкулезным препаратам (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, этионамид,каномицин, микобутин, амикоцин, ломефлоксацин). Больной обследован при поступлении в стационар, исследованы лимфоциты периферической крови. Спектроскопический анализ клеточной суспензии показал, что параметр равен 0,95 и это в 3 раза ниже значения контроля (здоровые доноры). Таким образом, мы могли диагностировать туберкулез легких у данного больного. Использование предлагаемого способа диагностики туберкулеза легких в клинической практике позволит быстро, информативно и достоверно диагностировать заболевание туберкулезом легких. Предлагаемый способ безопасен для обслуживающего персонала. Источники информации 1. Заявка на изобретение РФ 2004124989/15 от 16.08.2004, МПК 0133/569, публ. 2006. 2. Заявка на изобретение РФ 2004130304 от 11.03.2003, МПК 0133/48, публ. 2005. 3. Лобанок Е.С. Эндогенные порфирины в животных клетках механизмы образования и фотодинамическая активность // Биофизика живых систем от молекулы к организму / Под. ред. Волотовского И.Д., 2002. - С. 161-173. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4