Штамм Pseudomonas aeruginosa КМИЭВ-В 122 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Лемиш Артм Петрович Андрусевич Андрей Сергеевич Станкуть Виталий Эдвардович Станкуть Александр Эдвардович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) ШтаммКМИЭВ-В 122 - штамм-антиген. Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма,предназначенного для конструирования вакцин против псевдомоноза животных, средств специфической профилактики и лечения. Известен штамм-7 - штамм-антиген, который накапливает экзотоксинпри культивировании на бульоне Мартена (с содержанием 2 0,08 мкг/мл 0,05 глутамата натрия 1 глицерина) при температуре 32 С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м 3/ч. Биологическая активность культурального супернатанта штамма составляет 200 50/мл, а антигенная активность - 7 2 1. Известен штамм, исходные культуры которого обладали вирулентностью, значение 50 которого составляет 0,59109 микробных клеток 2. Однако эти известные штаммы обладают недостаточным накоплением продукции экзотоксина , низкой антигенной активностью и слабой вирулентностью для изготовления биопрепаратов в больших объемах. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, обладающего способностью высокого накопления продукции экзотоксина ,способностью длительно сохранять высокую вирулентность и более высокой антигенной активностью. Поставленная задача достигается тем, что штамм выделен из спермы больного псевдомонозом хряка в 2009 году в Минском ПП РБ Несвижского района, Минской области. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм (КМИЭВ-В 122) отнесен к видуродасемейства . 15957 1 2012.06.30 Патогенность для животных. Штамм патогенен для лабораторных животных при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Культурально-морфологические признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культурах, окрашенных по Граму, имеет вид прямых или слегка изогнутых грамотрицательных палочек размером 0,5-1,01,5-5,0 мкм. Подвижные,число жгутиков 1, спор и капсул не образуют. Аэробы. Не растут в кислой среде ( 4,5). В МПБ в первый день выращивания дает легкое равномерное помутнение среды с образованием на поверхности среды пристеночного кольца, содержащего флюоресцирующий пигмент (пиоцин) сине-зеленого цвета на 2-4 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде косички. При активном встряхивании происходит перераспределение пигмента с усилением цвета. На МПА развиваются в основном два вида колоний большие (диаметром 2-5 мм), сероватые,полупрозрачные, гладкие, с плоскими краями и выпуклым центром и мелкие, шероховатые. Вокруг колоний образуется зона, окрашенная в зеленый цвет различных оттенков(флюоресцеин, светящийся при облучении ультрафиолетом). Оптимальная температура культивирования 37 С. Растет на питательных средах при 42 С. Биохимические свойства. Штамм(КМИЭВ-В 122) по биохимическим свойствам обладает способностью ферментировать глюкозу с образованием кислоты без газа. Не образует индол. Использует нитраты в качестве источника азота. Антигенный состав. Имеет в своем составе - и -антигены. Другие особенности и маркерные признаки. Штаммобразует флюоресцирующий пигмент (пиоцин) сине-зеленого цвета. Растет на питательных средах при 42 С. Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в течение 5 лет при температуре 2-4 С. Культивируют путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера - 1 раз в течение месяца. Антигенные свойства. Антигенная активность штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена - в РИГА составляет 9 2. Иммуногенность штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена составляет 90 . Вирулентность. Штамм(КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 0,3109 м.к. Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к следующим антибактериальным препаратам норфлоксацину, офлоксацину, карбеницилину, гентамицину, полимиксину, неомицину, цефуроксину, левомицетину. 1. Пример выделения штамма(КМИЭВ-В 122) - штаммаантигена. Штамм(КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген - выделяли путем посева спермы хряков-производителей, больных псевдомонозом, на МПБ. Пробирки оставляли в термостате при 37 С на 12-18 часов. Через указанное время отмечали помутнение среды с образованием сине-зеленого пигмента. 2. Пример культивирования штамма(КМИЭВ-В 122) штамма-антигена. Выращивание данного штамма осуществляли на ферментере Фермус-1 на бульоне Мартена (с содержанием 2 0,08 мкг/мл 0,05 М глутамата натрия 1 глицерина) при температуре 32 С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м 3/ч. Контроль накопления экзотоксинаосуществляли в реакции преципитации. Результаты исследований отображены в таблице. Таким образом, заявляемый штамм(КМИЭВ-В 122) - штаммантиген - накапливает экзотоксинна питательной среде (бульон Мартена) при температуре 32 С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м 3/ч и обладает большей по сравнению с прототипом (200 50/мл) биологической активностью культуральных супернатантов, которая составляет 150 50/мл (меньшая доза введения обладает большей летальностью, т.е. большей биологической активностью), с наличием четких линий пре 2 15957 1 2012.06.30 ципитации в реакции двойной диффузии в геле с моноспецифической сывороткой к очищенному токсину в разведении 116. Накопление продукции экзотоксина.при культивировании на бульоне Мартена Средние показатели активности культуральных супернатантов различными методами Число иммунохимическим Штамм Среда культивирования опытов биологиче- реакция преципитации (в разведении ским(в 50/мл) культурального супернатанта) Бульон Мартена (с содержанием КМИЭВ 2 0,08 мкг/мл 0,05 М глу 5 150 50/мл 116 В 122 тамата натрия 1 глицерина) Бульон Мартена (с содержанием Известный 2 0,08 мкг/мл 0,05 М глу 5 200 50/мл 18 штамм тамата натрия 1 глицерина) 3. Пример определения вирулентных свойств штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена. Вирулентные свойства изучали в опытах на белых мышах живой массой 14-16 г, с этой целью готовили суспензию суточной агаровой культуры данного штамма в физиологическом растворе натрия хлорида. Животных заражали десятикратными разведениями подкожно в области спины в дозе 0,5 мл. За опытными животными вели наблюдение в течение 10 суток после заражения. На каждую заражающую дозу использовали по 10 животных. Расчет 50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина результаты исследований показали, что 50 штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена - составила 0,3109 микробных клеток. 4. Пример определения антигенной активности штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 11024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штамма(КМИЭВ-В 122) - штаммаантигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штамма(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена - составляет 9 2. Таким образом, штамм(КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген - обладает свойством накопления продукции экзотоксина А для изготовления вакцины с активностью культурального супернатанта, среднее значение биологической активности которого составляет 150 50/мл, что в 1,3 раз больше по сравнению с известным штаммом, обладающего способностью сохранять длительно высокую вирулентность 50 0,3109 (у известного штамма 0,59109) и более высокой антигенной активностью - 9 2(у известного штамма 7 2). Заявленный штамм может быть использован в качестве штамма-антигена для конструирования профилактических и диагностических препаратов. Источники информации 1. Бородина Н.С., Баскакова Н.В., Мороз А.Ф., Вертиев Ю.В., Мокриевич Н.М. Продукция экзотоксина А при культивировании-7 на бульоне Мартена // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1984. -4. - С. 22-26. 2. Дзюбак С.Т. Вирулентность и токсигенность культурразного происхождения // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1984. -1. - С. 50-53(прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3