Способ прогнозирования врожденного порока сердца у плода

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВРОЖДЕННОГО ПОРОКА СЕРДЦА У ПЛОДА(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Плоцкий Андрей Романович Егорова Татьяна Юрьевна Наумов Александр Васильевич Дорошенко Евгений Михайлович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(56)2308034 1, 2007.2168179 С 2, 2001. УЛЬФАН Т.Н. Роль системы плацентарного глутатиона в патогенезе осложнений беременности (клиническое исследование) Автореф. дис.- Иркутск,2003.- С. 22-24.(57) Способ прогнозирования врожденного порока сердца у плода, отличающийся тем,что определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флюоресцентной детекцией уровни общего глутатиона и общего гомоцистеина в отмытых эритроцитах крови беременной женщины, рассчитывают коэффициент, равный отношению уровней глутатион/гомоцистеин, и, если уровень глутатиона составляет 500-700 мкмоль/л и/или коэффициент равен 300-500, прогнозируют вероятность врожденного порока сердца у плода. Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, гинекологии и пренатальной диагностике, и может использоваться для прогнозирования риска развития врожденного порока сердца у плода. Проведя патентный поиск, нами не выявлено близкого к предлагаемому способа прогнозирования и диагностики врожденных аномалий развития у плода. Задача изобретения - обеспечение возможности прогнозирования вероятности формирования врожденного порока сердца у плода в целях проведения качественной и своевременной диагностики этих состояний. Указанная задача решается путем определения уровня общего глутатиона и общего гомоцистеина в отмытых эритроцитах крови беременной женщины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ( - -) с флюоресцентной детекцией и расчета коэффициента глутатион/гомоцистеин. Если уровень глутатиона составляет 500-700 мкмоль/л и/или коэффициент равен 300-500, прогнозируют высокую вероятность врожденного порока сердца у плода. Способ осуществляют следующим образом. 13111 1 2010.04.30 У всех пациенток утром натощак забирают кровь из локтевой вены, помещают в пробирки с гепарином и сразу же центрифугируют в течение 5 минут с частотой оборотов 2000 в минуту. Полученную плазму удаляют, а в пробирку добавляют физиологический раствор хлорида натрия, предварительно подогретый до 37 С, в соотношении 13. Полученную смесь центрифугируют при 2000 оборотах в минуту в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляют и снова добавляют физиологический раствор хлорида натрия в той же пропорции и при той же температуре. Описанную процедуру осуществляют 3 раза Камышников Методы клинических лабораторных исследований. Лабораторная диагностика учебник по специальности.- Минск Бел. наука, 2002. Затем отмытые эритроциты отбирают автоматической пипеткой в количестве 1 мл, помещают в пробирку,замораживают при температуре -18 С. В дальнейшем образцы отмытых эритроцитов хранят при температуре -78 С до момента проведения анализа. Уровень общего глутатиона и общего гомоцистеина отмытых эритроцитов определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ( - -) с флуоресцентной детекцией с использованием высокореагентного восстановителя ( 721,34-) фирмы(Германия) на аппарате 1100. В день проведения анализа образцы замороженных отмытых эритроцитов размораживали при комнатной температуре и добавляли к ним равный объем воды, после чего гомогенизировали. 50 мкл полученного гомогената смешивали с 5 мкл раствора ТСЕР 2 (100 мг/мл), после чего оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Затем осаждали белки добавлением 50 мкл 10 раствора ТХУ (трихлоруксусная кислота) и центрифугировали при 4 С в течение 15 мин при 16000 . В микропробирку объемом 200 мкл, содержащую 2 мкл 1,55 М , 12,5 мкл 0,125 М -боратного буфера с 200 мг/л ЭДТА, рН 9,5, и 5 мкл раствора - ( 72-1,34-) (1 мг/мл) в аналогичном буфере, вносили 10 мкл супернатанта и инкубировали 1 ч при 60 С. После охлаждения при комнатной температуре в систему вводили 10 мкл реакционной смеси,,. . ., 1997. . 43(4).- . 687-688. Разделение осуществляли на колонке Диасорб 130 С 16 Т, 3250 мм, 7 мкм. Подвижная фаза 0,1 М 24, 17 мМ СН 3 СООН, рН 3,65, 40 мг/л ЭДТА, 3 ацетонитрила. Скорость потока 0,6 мл/мин, температура колонки 30 С. Детектирование осуществлялось по флуоресценции, 379/510 нм. Определения проводили на хроматографической системе 1100, содержащей 4-канальный градиентный насос, термостат колонок, автосамплер и детектор флуоресценции. Регистрация хроматограмм и их количественная обработка осуществлялись с помощью 10.01. Если уровень глутатиона в отмытых эритроцитах составляет 500-700 мкмоль/л и/или коэффициент глутатион/гомоцистеин равен 300-500, прогнозируют высокую вероятность врожденного порока сердца у плода. Полученные результаты обработаны с помощью методов непараметрической статистики с использованием стандартных компьютерных программ 6.0,. Рассчитывались медиана, 25 и 75 процентили (, 25 , 75 ). Сравнение групп осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни. При помощи метода четырехпольных таблиц рассчитывались основные операционные характеристики теста определения уровня общего глутатиона и коэффициента глутатион/гомоцистеин в отмытых эритроцитах чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного результата. Для доказательства заявляемого способа проведено исследование уровней общего глутатиона и общего гомоцистеина в отмытых эритроцитах у 69 беременных женщин, которые были разделены на 2 группы. Основную группу составили 17 пациенток, у которых имелись различные виды врожденных пороков сердца у плода (табл. 1), подтвержденные 2 13111 1 2010.04.30 при патологоанатомическом исследовании абортусов либо при обследовании новорожденных детей. Таблица 1 Характеристика выявленных врожденных пороков сердца Количество наВид врожденных пороков сердца блюдений Дефекты межпредсердной или межжелудочковой перегородки 3 Сочетание дефекта перегородки и общего артериального ствола 4 Коарктация аорты 2 Транспозиция магистральных сосудов 2 Синдром гипоплазии левых отделов сердца 3 Аномальный дренаж легочных вен 1 Полная форма атриовентрикулярной коммуникации 1 Тетрада Фалло 1 Всего 17 Группу сравнения составили 52 пациентки, которые родили детей без врожденных аномалий. Уровни общего глутатиона, общего гомоцистеина и значения коэффициента глутатион/гомоцистеин в отмытых эритроцитах у пациенток основной группы и группы сравнения представлены в табл. 2. Таблица 2 Значения уровней общего глутатиона (мкмоль/л), общего гомоцистеина (мкмоль/л) и коэффициента глутатион/гомоцистеин в отмытых эритроцитах у пациенток основной группы и группы сравнения ГлутатионГомоцистеинГлутатион/гомоцистеин Исследуемые группы(485,283-800,39)- различия с группой сравнения достоверны (р 0,05). При уровне общего глутатиона в отмытых эритроцитах 500-700 мкмоль/л диагностическая чувствительность теста составляет 41,6 , диагностическая специфичность 70,7 , прогностическая ценность положительного результата теста - 22,6 . При значениях коэффициента глутатион/гомоцистеин в отмытых эритроцитах в интервале 300-500 диагностическая чувствительность теста составляет 41,6 , диагностическая специфичность - 80,48 , прогностическая ценность положительного результата теста - 22,6 . Таким образом, заявляемый способ прогнозирования врожденного порока сердца у плода позволяет сформировать группы риска среди беременных женщин для проведения дополнительных диагностических мероприятий с целью подтверждения или исключения подобного вида врожденных аномалий. Данный способ может быть применен в работе медико-генетических консультаций и перинатальных центров для прогнозирования высокой вероятности возникновения врожденных пороков сердца у плода. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3