Способ адаптации растений, полученных в культуре in vitro, к выращиванию в условиях ex vitro

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Титок Владимир Владимирович Перебитюк Александр Николаевич Кубрак Светлана Владимировна Хотылева Любовь Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ адаптации растений, полученных в культуре, к выращиванию в условиях, отличающийся тем, что перед высадкой растений почву и корневую систему растений обрабатывают суспензией бактерий - супрессоров фитопатогенов. Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к тем методам культивирования растений в условиях, где требуется укоренение полученных регенерантов и адаптация их к выращиванию в естественных условиях ( ). Изобретение может использоваться для успешного развития различных направлений культуры тканей при получении безвирусного посадочного материала, микроклональном размножении редких генотипов и селекционных новинок, отдаленной и соматической гибридизации, получении трансгенных растений различных сельскохозяйственных культур. Известен метод адаптации пробирочных растений к выращиванию в грунте при помощи заражения микоризой 1. Гифы гриба тесно контактируют с корнями растений,глубоко внедряются в окружающую почву, дальше, чем непосредственно корни самого растения, поэтому корневая система растения значительно увеличивается. Симбиоз между грибами и растениями способствует улучшению питания растений, усиливает рост биомассы, повышает устойчивость к засухе и лишь в незначительной степени защищает от вредителей 2. Повысить адаптационную способность пробирочных растений до некоторой степени помогают такие приемы как регулирование гормонального баланса, увеличение интенсивности освещения, повышение влажности 3, 4, а также обеззараживание грунта методами автоклавирования и пропусканием электрического тока 5. При автоклавировании используют давление пара в 1-3 атмосферы, температуру 100 С и более. При стерилизации грунта электрическим током используют напряжение 220 вольт, сила 11993 1 2009.06.30 тока 10-15 ампер, при этом грунт нагревается до 110 С 5. Под действием физических факторов (температура, давление) погибают микроорганизмы, личинки и взрослые особи вредителей. Наиболее близким к заявляемому является метод адаптации растений к условиям, основанный на последовательной обработке корневой системы растенийрегенерантов сначала 1 -ным раствором марганцовокислого калия (для предотвращения инфицирования), а затем в течение 3-5 мин индолилуксусной кислотой в концентрации 10-15 мг/л (для закладки новых корневых зачатков). В данном прототипе сочетаются два способа адаптации - стерилизация грунта и обработка корневой системы растений. Почвенную смесь стерилизуют в течение 15-20 мин при давлении 0,1-0,15 мПА и температуре 115-120 С. Простерилизованый субстрат заливают 1 -ным раствором марганцовокислого калия на 30-40 мин. Растения-регенеранты также помещают в 1 -ный раствор марганцовокислого калия, а затем на 3-5 мин в раствор индолилуксусной кислоты в концентрации 10-15 мг/г 11. Недостатком данного метода является то, что обработка грунта автоклавированием и раствором марганцовокислого калия неспецифически уничтожает вместе с фитопатогенами почвенные симбионты растений (нитрифицирующие, целлюлозоразлагающие бактерии) и другие важные группы микроорганизмов. Кроме того, ухудшается структура субстратов за счет повышения концентрации магния, алюминия. Без применения каких-либо приемов адаптации наблюдается снижение адаптивной способности растений до полной ее потери. Наиболее заметным морфологическим признаком при снижении адаптации у регенерантов является постепенная деградация корневой системы 6. Наблюдаемое явление может определяться разными факторами(нарушение эндогенного гормонального баланса, стрессовое состояние при пересадке в грунт и др.), которые в конечном итоге приводят к снижению резистентности растений и инфицировании их различными фитопатогенами. В связи с вышеперечисленным, недостатками прототипа является невозможность с помощью названных методик повысить защитный эффект растений-регенерантов. Кроме того, при стерилизации грунта по общепринятой методике 4 споровая инфекция не уничтожается. Более жесткие условия стерилизации приводят, как указывалось выше, к изменению состава грунта, вплоть до фитотоксичности. Задачей предлагаемого способа адаптации является улучшение состава грунта для пересадки путем создания специфической микрофлоры, при этом стерилизация грунта не обязательна. Способ основан на применении микробов-супрессоров, благодаря которым осуществляется биоконтроль за почвенными фитопатоганами. Заявленный способ адаптации растений кпозволяет повысить неспецифическую резистентность регенерантов к широкому кругу почвенных патогенов, способствуя тем самым интенсивному развитию корневой системы. Специфические штаммы микробов-супрессоров конкурируют с почвенными патогенами за условия питания, при этом не уничтожая, а сдерживая их распространение. Регулирование микрофлоры почвы при помощи супрессии фитопатогенов позволяет сохранить сбалансированный состав грунта и защитить растениярегенеранты от инфекции. Наблюдаемое при этом интенсивное развитие корневой системы способствует быстрому установлению оптимального эндогенного баланса гормонов,что позволяет растениям быстро адаптироваться к новым условиям выращивания 7, 8. Сущность заявляемого способа заключается в том, что корневую систему растенийрегенерантов, полученных в культуреи полностью отмытой от питательной среды,помещают в суспензию бактерий-супрессоров. Культуральную среду бактерий разводят дистиллированной водой до концентрации, достаточной для поддержания необходимой плотности бактериальной популяции и супрессорной активности, в которую помещают корневую систему растений на 10 минут - время, необходимое для заражения бактериями корневой системы растения. Перед высадкой растений в горшочки грунт увлажняют раствором бактерий-супрессоров (количество раствора рассчитывают, исходя из типа грунта 2 11993 1 2009.06.30 и объема горшочка, при этом конечная концентрация бактерий-супрессоров должна быть достаточной для поддержания необходимой плотности бактериальной популяции и супрессорной активности). Приживаемость растений определяют по количеству адаптированных регенерантов к общему количеству высаженных в почву растений. Предлагаемый способ адаптации растений к условиямреализован на регенерантах льна-долгунца (.), которые характеризуются особенно низкой адаптационной способностью. В качестве антагонистов почвенных патогенов выбраны бактерии рода , которые являются доминирующими в ризосфере растений,культивируемых в умеренной климатической зоне. Корневую систему растенийрегенерантов льна-долгунца помещали на 10 минут в суспензию бактерии рода , относящихся к группе флюоресцирующих псевдомонад (в данном случае использовали конечную концентрацию 104-106 микробных клеток в 1 см 3 раствора). Перед высадкой растений в горшочки грунт также увлажняли раствором бактерий-супрессоров (конечная концентрация аналогична приведенной выше). Растения-регенеранты льна-долгунца, обработанные суспензией бактерий-супрессоров в сочетании с обработкой фунгицидом ТМТД (тетраметилтиурамдисульфид, тирам, тиурам Д) и без нее, проявляли максимально высокую адаптационную способность при пересадке в грунт. Контролем служили растения, которые высаживались в стерильный грунт, без предварительной обработки, и растения, обработанные по общепринятой методике 0,2 раствором фунгицида ТМТД в течение 1 минуты с последующим промыванием корневой системы проточной водой для удаления препарата 9, 10. Результаты повышения адаптационной способности растений льна-долгунца предложенным способом поясняются таблицей. Общее количество регенерантов, шт без 25 Растения обработки Растения после обработки ТМТД Растения после обработки бактериямиантагонистами Растения после обработки ТМТД и бактериямиантагонистами Количество не прижившихся растений, шт 24 Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что среди растений, не подвергшихся обработке, только 4 регенерантов смогли приспособиться к условиям. При обработке только ТМТД количество адаптированных растений возрастает до 34,6 . При обработке суспензией бактерий-супрессоров в сочетании с обработкой фунгицидом ТМТД и без нее количество адаптированных растений значительно возрастает и составляет 92,6 и 91,3 соответственно. Значительные различия в адаптационной способности к условиямпосле применения бактерий-супрессоров и без них свидетельствуют об эффективности заявляемого способа защиты растений-регенерантов. 11993 1 2009.06.30 Источники информации 1. Калашникова Е. Размножение хвойных пород методом культуры тканей // Лесоводство и лесоразведение. - 1993. -24. - С. 44. 2.,В.// . 2004. -14. - . 145-163. 3. Шарафундинова Г.Г. и др. Сравнительный анализ гормонального баланса растений картофеля различной длительности культивированияВестник Башкирского университета. - 2001. -2. - С. 133-135. 4. Методические рекомендации по получению трансгенных растений льна-долгунца. М., 2001. 5. Тепличное овощеводство. - Свердловск Сред.-Урал. кн. изд-во, 1989. - 208 с. 6. Мардамшин А.Г., Шарафундинова Г.Г Влияние длительности культивирования картофеляна приживаемость растений при переходе от гетеротрофного питания к автотрофному // Биотехнология. - 2000. -3. - С. 38-41. 7.//. - 2001. -52. - . 487-511. 8.// . . . - 1988. -26. - . 379-407. 9. Калацкая Ж.Н., Ламан Н.А. Особенности роста, развития и продуктивность растений ярового ячменя (.) при обработке семян дифенилмочевиной с фунгицидом тетраметилтиурамдисульфид // Известия Национальной академии наук Беларуси серия биологических наук. - 2006. -4. - С. 17-24. 10. Лен Беларуси монография. РУП БелНИИ льна / Под ред.И.А. Голуба. - Мн.,2003. - 245 с. 11.1792269, 1993. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4