Рекомбинантная клетка Mycobacterium bovis для получения противотуберкулезной вакцины с улучшенной эффективностью

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНАЯ КЛЕТКАДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ВАКЦИНЫ С УЛУЧШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ(71) Заявитель МАКС-ПЛАНК-ГЕЗЕЛЬШАФТ ЗУР ФРДЕРУНГ ДЕР ВИССЕНШАФТЕН Е.В.(73) Патентообладатель МАКС-ПЛАНКГЕЗЕЛЬШАФТ ЗУР ФРДЕРУНГ ДЕР ВИССЕНШАФТЕН Е.В.(57) 1. Дефицитная по уреазе клеткадля получения вакцины, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий в себя, по меньшей мере, (а) один домен из полипептида, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и (б) домен выхода из фаголизосом. 2. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что дефицит по уреазе получен инактивацией последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, одну субъединицу клеточной уреазы. 3. Клетка по п. 2, отличающаяся тем, что инактивирована, по меньшей мере, последовательность, кодирующаясубъединицу клеточной уреазы. 4. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен выхода из фаголизосом представляет собой домен выхода из фаголизосом . 5. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен выхода из фаголизосом кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, представляющей собой(а) последовательность нуклеотидов, включающую нуклеотиды 211-17221,(б) последовательность нуклеотидов, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность (а) или(в) последовательность нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с последовательностью (а) или (б). 6. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен способен вызывать иммунный ответ,который представляет собой ответ МНС рестрицирующихся по классу 8 Т-клеток. 7. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой иммуногенный фрагмент полипептида из . 8. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой антиген , выбранный из 85 .,15197 1 2011.12.30 85 ., 85 . и -6 ., либо его иммуногенный фрагмент. 9. Клетка по п. 8, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой антиген 85 либо его иммуногенный фрагмент. 10. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что кодируемый слитый полипептид содержит в своем начале сигнальную пептидную последовательность. 11. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что между доменом, вызывающим иммунный ответ, и доменом выхода из фаголизосом расположен пептидный линкер. 12. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты операбельно связана с последовательностью, контролирующей ее экспрессию. 13. Клетка по п. 12, отличающаяся тем, что последовательность, контролирующая экспрессию, активна в указанной клетке. 14. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты расположена в векторе. 15. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен из полипептида либо полипептид,способный вызывать иммунный ответ, выбран из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного фрагмента. 16. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что способна экспрессировать, по меньшей мере, одну указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты. 17. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что способна секретировать полипептид, кодируемый указанной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты. 18. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что имеет внутриклеточную стабильность в макрофаге, равную или меньше внутриклеточной стабильности нативной клетки. 19. Дефицитная по уреазе клеткадля получения вакцины, содержащая, по меньшей мере, одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид выхода из фаголизосом. 20. Клетка по п. 19, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего. 21. Клетка по п. 20, отличающаяся тем, что пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ, выбран из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного фрагмента. 22. Клетка по п. 19, отличающаяся тем, что способна экспрессировать, по меньшей мере, одну указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты. 23. Клетка по п. 22, отличающаяся тем, что способна секретировать полипептид, кодируемый указанной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты. 24. Клетка по п. 21, отличающаяся тем, что имеет внутриклеточную стабильность в макрофаге, равную или меньше внутриклеточной стабильности нативной клетки. 25. Способ приготовления дефицитной по уреазе клеткипо п. 1,включающий стадии получение дефицитной по уреазе клетки вставка в указанную клетку рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид, который содержит, по меньшей мере, (а) один домен из полипептида, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и (б) домен выхода из фаголизосом. 26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, выбирают из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного фрагмента. 2 15197 1 2011.12.30 27. Способ приготовления дефицитной по уреазе клеткипо п. 19,включающий стадии получение дефицитной по уреазе клетки вставка в указанную клеткурекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид либо полипептид выхода из фаголизосом. Настоящее изобретение касается новых рекомбинантных вакцин, обеспечивающих защитный иммунитет в особенности против туберкулеза. Туберкулез (ТВ), который вызывается микроорганизмом,остается существенной глобальной проблемой. Подсчитано, что каждый третий представитель мирового населения инфицирован . (, 1991). Во многих странах единственным способом контроля заболеваемости ТВ являлась вакцинация с использованием бациллы . -. Однако средняя общая эффективность вакциныпротив ТВ составляет примерно 50 , и значения ее сильно варьируют в пределах от 0 до 80 в разных конкретных случаях (., 1995). Таким образом, должна быть улучшена, например посредством генной инженерии, с целью получения вакцины, позволяющей лучше контролировать заболеваемость ТВ (., 1996, 1993). Такая широко распространенная опасность, как множественная лекарственная устойчивость штаммов ., дополнительно подчеркивает срочную необходимость в новых ТВ вакцинах (, 1996).. относится к группе внутриклеточных бактерий, которые размножаются внутри фагоцитарных вакуолей покоящихся макрофагов, таким образом, защита против ТВ зависит от -клеточного иммунитета (, 1993). Однако некоторые исследования, проведенные на мышах и человеке, показали, чтостимулируют антигенспецифичные 4 и 8 клетки, несущие главный комплекс гистосовместимости классаили классапо рестрикции, соответственно (, 1993). Важная роль 8 клеток, несущихклассапо рестрикции, была убедительно продемонстрирована посредством неудавшегося эксперимента по контролю экспериментального инфицирования микроорганизмами . мышей, дефицитных по 2-микроглобулину (2) (., 1993). Поскольку эти мутантные мыши не имеюткласса , функциональные 8 клетки не могут развиваться. В отличие от инфекции., 2-дефицитные мыши способны усваивать определенные инфекционные дозы вакцины на основе штамма(., 1993., 1995). Более того, вакцинация 2-дефицитных мышей продлевала срок их выживания после последующего инфицирования ., когда -иммунизированные 57/6 демонстрировали устойчивость к ТВ (., 1993). Такая различная 8 -клеточная зависимость между . иможет быть объяснена следующим антигены. имеют лучший доступ в цитоплазму, нежели антигены из , что приводит к более выраженной представленностикласса(, 1993). Следовательно, более эффективный 8 -клеточный ответ генерируется Данное предположение было позже подтверждено повышенной представленностьюклассав случае не относящегося к делу антигена, овальбумина, совместной с ., лучше чем с , инфекцией антиген-представляющих клеток(., 1996). Секретируемые белки . включают ценный источник антигенов для представлениякласса . Недавно ДНК вакцина, кодирующая секретируемый антиген 85, вызвала ответы 8 клеток, несущихклассапо рестрикции у мышей,которые могут способствовать защите от ТВ (., 1996). Вообще, накопленные данные показывают, что иммунизация секретируемыми белковыми антигенами . индуцирует некоторую защиту от ТВ у морских свинок и мышей (.,1995 , 1994). Следовательно, важной задачей на пути к разработке улучшенных ТВ вакцин на основеявляется увеличение доступности цитоплазмы инфицирован 3 15197 1 2011.12.30 ныхдля секретируемых, -специфичных антигенов. Последующая доставка пептидов, являющихся производными этих секретируемых белков, в последовательность событий представленияклассаможет привести к усилению уже существующего-специфичного иммунного ответа, предупреждающего заболевание ТВ. Высвобождение из фаголизосом . представляет собой уникальный механизм усиления представления листериальных антигеновкласса(.,1987., 1988). Листериолизин , порообразующий сульфгидрилактивируемый цитолизин, необходим для высвобождения микроорганизмов . из фаголизосомальных вакуолей в цитозоль клетки хозяина (., 1987.,1988). Данная функция высвобождения была недавно передана штаммуи ослабленному в своей вирулентности штамму. (., 1991., 1995, 1997). Экспрессиямутантным штаммом неспорообразующих . или. приводила в результате к высвобождению бактерий из фаголизосом в цитозоль 774 макрофаг-подобных клеток (., 1991., 1995, 1997).99/101496 и. (1998) описывают рекомбинантные штаммы, которые секретируют биологически активные листериолизин-слитые белки. Было показано, что данные штаммы . являются эффективными вакцинами против ТВ в случае нескольких животных моделей. В соответствии с настоящим изобретением,был экспрессирован в дефицитных по уреазе штаммах . Эти дефицитные по уреазе штаммыдемонстрируют повышенную активностьв фагосомах и, в свою очередь, повышенную эффективность порообразования в мембранах эндосом, что свидетельствует об их превосходной эффективности иммунной защиты. Кроме того, дефицитные по уреазе штаммы - вовлечены в процессы апоптоза, которые могут также вносить свой вклад в наблюдаемое усиление иммунной защиты. Таким образом, имеются широкие возможности по созданию вакцин на основе дефицитных по уреазе штаммов . Кроме того, было неожиданно обнаружено, что дефицитные по уреазе штаммыявляются более безопасными по сравнению с родительскими штаммамии, таким образом, могут применяться, в частности, для вакцинации пациентов, страдающих иммунодефицитом. Первым аспектом настоящего изобретения является бактериальная клетка, а именно дефицитная по уреазе клетка , содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый полипептид, включающий (а) как минимум один домен из полипептида, в котором данный полипептидный домен способен вызывать иммунный ответ у млекопитающих, и (б) домен, ответственный за высвобождение из фаголизосом. Предпочтительно, чтобы клетка была способна экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся предметом настоящего изобретения. Более предпочтительно,чтобы клетка была способна секретировать слитый полипептид и/или предоставлять его в форме, пригодной для распознавания антигенаклассапо рестрикции. Бактериальная клетка, являющаяся предметом настоящего изобретения, - это клетка,дефицитная по уреазе, например, грамотрицательная либо грамположительная бактериальная клетка, предпочтительно клетка . Дефицитность по уреазе может быть достигнута посредством частичной либо полной инактивации одной или нескольких клеточных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих субъединицы уреазы, в частности, в частности у . и ., а также кодируемые ими белки описаны в работах. (1995) и. (1995), которые включены в данное описание во всей своей полноте путем отсылки. Предпочтительно, когда дефицитный по уреазе бактериальный штамм получен посредством делеций и/или вставок одного либо нескольких нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют субъединицы уреазы, и/или в последовательно 4 15197 1 2011.12.30 сти, контролирующей их экспрессию. Делеции и/или вставки могут быть получены в результате гомологичной рекомбинации, вставки транспозона либо применения других подходящих методов. В рамках особо предпочтительного воплощения настоящего изобретения инактивирована последовательность , например, посредством конструирования вектора-самоубийцы, включающего ген , нарушенный с помощью селективного маркерного гена,трансформации клетки мишени данным вектором и скринингом с целью отбора положительных по селективному маркеру клеток, имеющих негативный по уреазе фенотип, как описано в. (1995). Клетка, являющаяся предметом настоящего изобретения, - это предпочтительно клетка ., клетка ., в частности ослабленная в своей вирулентности клетка., либо другая , например, ., ., .,. или ., или , как описано в. (1995). Клетка , являющаяся предметом настоящего изобретения, содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, например молекулу нуклеиновой кислоты.1. Данная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид (нуклеотид 1-120), последовательность, кодирующую иммуногенный домен (нуклеотид 121-153), последовательность, кодирующую пептидный линкер(нуклеотид 154-210), последовательность, кодирующую фаголизосомный домен (нуклеотид 211-1722), еще одну последовательность, кодирующую пептидный линкер (нуклеотид 1723-1800), и последовательность, кодирующую случайный пептид (нуклеотид 1801-1870). Соответствующая аминокислотная последовательность представлена в.2. Нуклеиновая кислота содержит как минимум один иммуногенный домен из полипептида. Иммуногенный домен может быть выделен из организма рода , предпочтительно изили из. Этот домен имеет длину как минимум 6 или предпочтительно как минимум 8 аминокислот. Иммуногенный домен - это, предпочтительно, часть нативного полипептида . Тем не менее,в объем настоящего изобретения включен также модифицированный иммуногенный домен,полученный из нативного иммуногенного домена посредством замены, делеции и/или вставки одной либо нескольких аминокислот. Иммуногенный домен, однако, не ограничивается антигеноми может быть выбран из числа аутоантигенов, раковых антигенов и антигенов патогена, таких как вирусные антигены, антигены паразитов, антигены бактерий вообще и их иммуногенные фрагменты. Специфические примеры подходящих раковых антигенов - это антигены рака человека, такие как продукт гена супрессора опухоли 53 (., 1993) и антигены дифференциации меланоцитов, например -/-1 и 100 (.,1996). Специфические примеры подходящих вирусных антигенов - это антигены вируса,опухоли человека, такие как антигены вируса папилломы человека, например антигены 6 и 7 (., 1991) антигены вируса гриппа, например нуклеопротеин вируса гриппа(., 1995., 1997) или антигены ретровирусов, такие какантигены,например -1 антигены 17, 24,и(., 1996., 1996). Конкретные примеры подходящих антигенов паразитов - это антигены , такие как антиген печеночной стадии (-1), белок круглого спорозоита (или аллельные варианты 2629) тромбоспондин-связаный безымянный белок ,треонин- и аспарагин- богатый белок спорозоита(., 1995) и антигены , такие как 30 из(., 1991, 1991). Конкретные примеры подходящих бактериальных антигенов это антигены , такие как Главный белок-помощник из(, 1991). Иммуногенный домен способен вызывать иммунный ответ у млекопитающих. Данный иммунный ответ может быть опосредованклеточным иммунным ответом. Предпочтительно, тем не менее, если иммуногенный домен способен вызывать опосредованный 5 15197 1 2011.12.30 клетками иммунный ответ, более предпочтительно 8 клеточный ответклассапо рестрикции. Домен, способный вызывать иммунный ответ, наиболее предпочтительно выбирается из иммуногенных пептидов либо полипептидов из . или ., или из их иммуногенных фрагментов. Специфические примеры подходящих антигенов - это 85(., 1996,., 1996., 1995). Более предпочтительно,когда иммуногенный домен получен из антигена 85. Наиболее предпочтительно, когда иммуногенный домен содержит последовательность из аминокислот с 41 до 51 в последовательности.2. В соответствии с настоящим изобретением, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты также включает домен выхода из фаголизосом, то есть полипептидный домен,который осуществляет высвобождение слитого полипептида из фаголизосом в цитозоль клетки млекопитающего. Предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом является доменом выхода из фаголизосом , который описан в 5 733 151, который включен в данное описание во всей своей полноте путем отсылки. Более предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом выделен из организма Наиболее предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной изпоследовательности нуклеотидов, включающей нуклеотиды 211-1722, как показано в.1,последовательности нуклеотидов, которая кодирует ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность из , и последовательности нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с последовательностями изили . Помимо последовательности нуклеотидов, представленной как.1, настоящее изобретение также включает в себя гибридизующиеся с ней последовательности нуклеиновых кислот. В рамках настоящего изобретения термин гибридизация используется,как это определено в. ( .,(1989), 1.101-1.104). В соответствии с настоящим изобретением,термин гибридизация используется в том случае, когда положительный гибридизационный сигнал может все еще наблюдаться после отмывки в течение одного часа с использованием 1 и 0,1 при 55 С, предпочтительно при 62 С и более предпочтительно при 68 С, и особенно в случае 1 часа в 0,2 и 0,1 при 55 С,предпочтительно при 62 С и более предпочтительно при 68 С. Последовательность, гибридизующаяся при таких условиях отмывки с последовательностью нуклеотидов, представленной как.1, является последовательностью нуклеотидов, кодирующей домен выхода из фаголизосом, предпочтительной для настоящего изобретения. Последовательность нуклеотидов, кодирующая домен выхода из фаголизосом, как описано выше, может быть прямо получена из организмалибо из любого рекомбинантного источника, например рекомбинантных клеток ., содержащих соответствующую молекулу нуклеиновой кислотыили ее вариант, как описано выше. Предпочтительно, когда рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Более предпочтительно, когда сигнальная последовательность является сигнальной последовательностью активной в , предпочтительно в ., например, нативной сигнальной последовательностью Предпочтительным примером подходящей сигнальной последовательности является последовательность нуклеотидов, кодирующая сигнальный пептид 85, которая представлена в.1 с нуклеотида 1 по 120. Кроме того, предпочтительно, чтобы пептидный линкер был введен между иммуногенным доменом и доменом выхода из фаголизосом. Предпочтительно, когда такой пептидный линкер имеет длину от 5 до 50 аминокислот. Более предпочтительно, когда последовательность кодирует линкер, соответствующий показанному в.1 с 6 15197 1 2011.12.30 нуклеотида 154 по 210, либо когда последовательность соответствует ей с учетом вырождения генетического кода. Нуклеиновая кислота может быть расположена в рекомбинантном векторе. Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор является прокариотическим вектором, то есть вектором, содержащим необходимые элементы для репликации и/или интеграции в геном в клетке прокариот. Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор несет молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся предметом настоящего изобретения, действенно связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию. Предпочтительно, когда контролирующая экспрессию последовательность является контролирующей экспрессию последовательностью активной в , в частности в Вектор может являться внехромосомным вектором либо вектором, пригодным для интеграции в хромосому. Примеры таких векторов хорошо известны профессионалам в данной области и, кроме того, описаны в работах. Следующим аспектом настоящего изобретения являются дефицитные по уреазе клетки бактерий, например клетки , предпочтительно клетки ., которые содержат хотя бы одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид выхода из фаголизосом. Даже в том случае, когда пептид либо полипептид выхода из фаголизосом не является слитым с антигеном, обнаруживается удивительное улучшение иммуногенных свойств. Рекомбинантная бактериальная клетка, представленная в соответствии с данным дополнительным аспектом настоящего изобретения, может содержать как минимум один дополнительный рекомбинант, например молекулу инородной нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающих. Такой дополнительный иммуногенный пептид либо полипептид может быть отобран из числа антигеновили, в широком смысле, из аутоантигенов,опухолевых антигенов, антигенов патогенов и их иммуногенных фрагментов. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дополнительный пептид либо полипептид, может быть расположена в том же векторе, что и слитый ген. Однако она также может располагаться, к примеру, на другой плазмиде, независимо от слитого гена, или быть интегрированной в хромосому. Было неожиданно обнаружено, что соответствующая настоящему изобретению клеткаимеет такую внутриклеточную стабильность в зараженных клетках,например макрофагах, которая одинакова или меньше, нежели внутриклеточная стабильность соответствующей нативной клетки , не содержащей рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента описанную выше клетку, не обязательно вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, носителями и адъювантами. Предпочтительно, когда композиция является живой вакциной, пригодной для введения млекопитающим,предпочтительно человеку. Фактически выбранный способ вакцинации зависит от выбора вакцинного вектора. Введение может осуществляться посредством введения единичной дозы либо повторяющихся доз через определенные интервалы времени. Подходящая дозировка зависит от различных параметров, таких как вакцинный вектор сам по себе, или способ введения. Может быть выбран способ введения через поверхность слизистой оболочки (например, глазной, интраназальный, оральный, желудочный, кишечный, ректальный, вагинальный или через мочевые пути) либо по парентеральному пути (например,подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно). Кроме того, настоящее изобретение касается способа приготовления рекомбинантных клеток бактерий, как описано выше. В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, данный способ включает такие стадии, какполучение дефицитной по уреазе бактериальной клетки, в частности клетки ,вставка рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в эту бактериальную клетку, причем данная молекула 7 15197 1 2011.12.30 нуклеиновой кислоты кодирует слитый полипептид, включающий в себя (а) как минимум один домен из полипептида, в котором этот домен способен вызывать иммунный ответ в клетках млекопитающих, и (б) домен выхода из фаголизосом, икультивирование клеток, полученных в соответствии со стадиейпри подходящих условиях. Предпочтительно, когда получена клетка, которая способна экспрессировать описанную молекулу нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно, когда клетка является клеткой В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения, данный способ включает в себя такие стадии, какполучение дефицитной по уреазе бактериальной клетки, в частности клетки ,вставка рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в эту бактериальную клетку, причем данная молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид либо полипептид выхода из фаголизосом, икультивирование клеток, полученных в соответствии со стадиейпри подходящих условиях. При желании, способ, являющийся предметом настоящего изобретения, включает в себя вставку в бактериальную клетку как минимум одной дополнительной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, причем данная молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающих. Наконец, данное изобретение касается способа приготовления живой вакцины, содержащей разработанные рекомбинантные клетки в фармацевтически эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, носителями и/или адъювантами. Благодаря высокой безопасности дефицитных по уреазе бактериальных клеток, которая была продемонстрирована на двух различных животных моделях (Пример 3), живая вакцина, являющаяся объектом настоящего изобретения, может быть в отдельных случаях пригодной для введения испытуемым с иммунодефицитом, например испытуемым, страдающим от инфекции, или субъектам, подверженным действию иммуносупрессорных препаратов. В особо предпочтительном воплощении, живая вакцина, являющаяся объектом настоящего изобретения, используется как туберкулезная вакцина для испытуемых с иммунодефицитом. В следующем предпочтительном воплощении, живая вакцина используется как опухолевая вакцина, например как вакцина против поверхностного рака мочевого пузыря. В следующем еще более предпочтительном воплощении настоящего изобретения, живая вакцина используется в области ветеринарии, например как вакцина против листериоза,туберкулида или бычьего туберкулеза. Настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано нижеследующими фигурами и списком последовательностей. Фиг. 1 демонстрирует защитную способностьв аэрозольной модели мышечного туберкулеза. / мыши были внутривенно иммунизованы с использованием 1106,либо нативной. Спустя 120 дней после вакцинации в организм животных было введено 37 (200 организм/легкие) посредством аэрозоля. Содержание бактерий в инфицированных органах(селезенка и легкие) было оценено через 30, 60 и 90 дней после введения. Каждая точка соответствует 10 животным. Фиг. 2 демонстрирует число микроорганизмов в легких (Фиг. 2) либо в селезенке(Фиг. 2). -/- мыши были инфицированы родительским штаммом(дикий тип),либо штаммом(-). Содержание бактерий в инфицированном органе было оценено через 30, 60 и 90 дней после инфекции. Фиг. 3 демонстрирует коэффициент выживаниямышей, инфицированных с использованиеми..1 показывает последовательность нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением..2 показывает соответствующую последовательность аминокислот молекулы нуклеиновой кислоты из.1. 8 15197 1 2011.12.30 Пример 1. Получение дефицитных по уреазе штаммови тесты на мышиной модели 1. Инактивация уреазной активности. С целью увеличить защитную способность штамма , содержащего белок(-), уреазная активность была удалена. Для получения дефицитного по уреазе мутанта,. сконструировали векторсамоубийцу, включающий в себя ген , нарушенный канамициновым маркером (ген ). Два микрограмма данного конструкта было линеаризовано с использованиемрестриктазы и введено в .путем электропорации. Устойчивые к канамицину трансформанты подверглись отбору на негативный по уреазе фенотип (., 1995). 2. Конструирование челночного.экспрессионного вектора 306. Для передачи функции выхода из фагосомы (опосредованной.1/2)(1173 3)был использован . - челночный вектор. Встраивающаяся в геном плазмида 306, предшественник вектора 361, делает возможной стабильную хромосомную экспрессию . Выделенный из -1 1,7-т.п.н.фрагмент ДНК, кодирующий открытую рамку считывания- (.152-специфичный гемолизин ), был вставлен всайт плазмиды 261. Полученный в результате слитый ген обеспечивал экспрессию секреторных белков, направляемых в супернатант посредством -специфичного сигнального пептида 85. Данный конструкт был назван 261 и его ДНК экспрессионная кассета -, находящаяся под транскрипционным контролем 60 микобактериального промотора, была последовательно использована для вставки в родительский вектор 306, приведшей к получению конструкта 306. Была проанализирована последовательность ДНК -специфичных сайтов вставки в обеих микобактериальных экспрессионных плазмидах. Предположительно, зрелый -слитый белок содержит 30 аминокислот наконце и 52 аминокислоты в -концевой части слитого белка, которые частично совпадают с. . 3. Защитная способность в рамках мышиной модели. Экспрессионный вектор 306 был трансформирован в дефицитный по уреазе штамм. Полученный в результате штамм был обозначен как. Защитная способность этого дефицитного по уреазе штамма микобактерий, в сравнении с родительскими, в случае модели мышечного туберкулеза показана на фиг. 1. Было неожиданно обнаружено, чтовызывал усиленную защиту уже в ранних временных точках (день 30 после инфекции), которая продолжалась в течение всего срока наблюдения (до дня 90). Был предпринят следующий эксперимент по длительной защите с использованием. / мыши были внутривенно вакцинированы с использованием, - или родительскогои обработаны с использованием аэрозоля на 120 день после вакцинации .37. - и родительскиевызывали соизмеримую по эффективности защиту против .37 к дню 90. В отличие от них,вызывал усиленную защиту уже в ранних временных точках, начиная со дня 30 после инфекции. Более того, данная усиленная защита длилась в течение всего периода наблюдения и показывала уменьшение содержания .37 в легких на 90 день после инфекции в более чем 2(кое), в сравнении с нативными мышами, и в более чем 1 по сравнению с мышами, вакцинированными родительским . Похожие результаты были получены после заражения клиническим изолятом.. / мыши были внутривенно иммунизированы с использованием, - или родительскогои обработаны с помощью аэрозоля на 120 день после вакцинации .. Вакцинация с использованием 9 15197 1 2011.12.30 вызывала усиленную защиту против .уже в ранних временных точках (день 30), которая продолжалась в течение всего срока наблюдения до дня 90 после инфекции. В сравнении с вакцинацией родительским , вакцинация с использованиемвела к уменьшению содержания .в легких в 1(кое). Пример 2. Длительная защита против .37 в морских свинках Поскольку мыши являются относительно устойчивыми к инфекции . ,морские свинки, как более восприимчивая животная модель, были использованы для проверки на вакцинационную способность. Морские свинки были подкожно иммунизированы с использованием соответствующего вакцинного штамма микобактерий,или родительского , и привес, также как и , наблюдался после введения .37. Морские свинки, иммунизированные с использованием, показывали одинаковый привес с теми животными, которые были вакцинированы родительским штаммомвплоть до дня 120, в то время как невакцинированные животные страдали от ТВ, о чем свидетельствовало падение привеса тела. Визуальная проверка легких и селезенки перед анализомпоказала, что туберкулы на поверхности обоих органов, взятых у -иммунизированных морских свинок, были намного больше по размеру и более многочисленны чем те, что были взяты у- вакцинированных животных. Пример 3. Оценка безопасностиМыши 1-/-, дефицитные по - и -клеткам, были инфицированы 106 микроорганизмами родительского штамма(дикий тип) или штамма. Наблюдалось присутствие микроорганизмов в легких и селезенке. Значительно уменьшенноебыли отмечены в легких (фиг. 2). В селезенке слегка уменьшенные значениябыли отмечены после инфекциив сравнении с инфекцией родительским(фиг. 2). Далее, безопасностьбыла протестирована на иммунодефицитныхмышах. Для этой целимыши были внутривенно привиты с использованием 107-108 микроорганизмовили родительского штамма . В то время какмыши, привитые родительским штаммом, умирали в срок до 25 после инъекции, мыши,привитые, выживали до 150 дня после инъекции (фиг. 3). Данные эксперименты продемонстрировали, чтоявляется более безопасной по сравнению с родительским штаммом . Источники информации 1. , ., , ., , . (1995),-,345 1003. 2. , . (1994),, . . 62 25362544. 3. , ., , , , , . (1995),, . . 154 3359. 4. , ., , .,, (1987),Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 19