Полисахарид с иммуностимулирующей активностью

(71) Заявитель БОМСУНД ГРУПО АСЕСОР, С.Л.(73) Патентообладатель БОМСУНД ГРУПО АСЕСОР, С.Л. 10037 1 2007.12.30 где 7-8. 2. Способ получения полисахарида формулыпо п. 1, включающий) обработку измельченного материала, полученного на стадии с), излучением красного линейного диодного лазера с длиной волны 150-810 нм, мощностью 1-60 Вт и диаметром луча 1-6 мм) суспендирование обработанного на стадии ) материала в воде) выдерживание суспензии, полученной на стадии е), для осуществления мацерации) лиофилизацию экстракта, полученного на стадии )) фракционирование метанолом лиофилизованного вещества, полученного на стадии )) отделение твердой фазы от жидкой фазы) фракционирование твердой фазы, полученной на стадии ), растворами метанола с конечной концентрацией 25 , 50 и 67) растворение в воде преципитатов, полученных на стадии ), при фракционировании 50 и 67 раствором метанола) биоанализ для идентификации активной фракции о) хроматографическое разделение активной фракции) биоанализ для идентификации активной фракции) удаление элюента. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что длина волны составляет 200-400 нм, предпочтительно, 250 нм, мощность - 20 Вт, диаметр луча равен 4 мм. 4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что каждый килограмм измельченного материала обрабатывают лазерным излучением в течение 3-10 минут, предпочтительно в течение 5 минут. 5. Применение полисахарида формулыпо п. 1 для получения лекарственного средства для лечения иммуносупрессивных заболеваний. 6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что иммуносупрессивное заболевание представляет собой раковое заболевание, туберкулез, грипп, насморк, аллергию, красную волчанку, псориаз или СПИД. 7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой рак печени, рак легких, рак почек, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак предстательной железы или аденокарциному предстательной железы, рак головного мозга, в частности, астроцитому или глиобластому, рак шейки матки или рак мочевого пузыря. 8. Фармацевтический препарат для лечения иммуносупрессивных заболеваний, содержащий полисахаридпо п. 1. 9. Фармацевтический препарат по п. 8, отличающийся тем, что дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. 10. Фармацевтический препарат по п. 8 или 9, отличающийся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, еще одно фармацевтически активное соединение. Настоящее изобретение относится к полисахариду формулы , обнаруживающему иммуностимулирующую активность, к способу его получения, к его применению при лечении иммуносупрессорных заболеваний, и к содержащим его фармацевтическим композициям. Иммунную систему можно определить как собрание молекул, клеток и органов, чьи сложные взаимодействия образуют эмерджентную систему, как правило, способную защитить индивидуума как от внешних посягательств, так и от собственных измененных клеток. 2 10037 1 2007.12.30 Иммунную систему можно разделить на две функционально различные части часть,элементы которой являются врожденными, и часть, элементы которой являются приобретенными. Врожденный иммунитет относят на счет иммунных элементов, которые неспецифические и неадаптивные. Они способны различать инородные ткани/организмы, но не способны распознавать определенного посягателя. Приобретенный иммунитет относят на счет элементов, которые специфичны и адаптивны. Они способны отличать инородные клетки от собственных и могут отличать один инородный антиген от другого. Приобретенный иммунитет обладает памятью. Это делает возможными иммунизацию и сопротивление повторному заражению тем же микроорганизмом. Клетками, ответственными за иммунитет, являются лимфоциты, у которых существует два подкласса - В- и Т-клетки. Приобретенного иммунитета можно добиться или путем естественного заражения или вакцинации (активным путем), или путем введения иммуноцитов (пассивным путем). В то время как на первом пути обнаруживается длительное действие, которое даже может стать постоянным, на последнем действие не является длительным. Пациентов с иммуносупрессорными заболеваниями лечат иммуностимуляторами, для того, чтобы активировать их иммунную систему. Различные иммуностимуляторы известны из 4801578,5417979,9851319. Иммуностимуляторы на основе полисахаридов известны из 18917177 и ЕР 0225496. В указанных патентах описываются полисахариды с иммуностимулирующей активностью и их получение из культур растительных клеток. В качестве растений используют,и. Однако ни один из указанных стимуляторов не обнаруживает удовлетворительной активности в случае иммуносупрессорных заболеваний. Таким образом потребность в других иммуностимуляторах, обнаруживающих улучшенную активность в широком спектре. Настоящее изобретение относится к полисахариду формулы , обнаруживающему иммуностимулирующую активность, способу его получения, его применению при лечении иммуносупрессорных заболеваний, и к содержащим его фармацевтическим композициям. В одном аспекте изобретение относится к полисахаридам формулы . Схема 13- где 7-8. Во втором аспекте изобретение относится к способу получения полисахарида формулы . Указанный способ включает, во-первых, получение водного экстракта из растенияи, во-вторых, выделение полисахарида с использованием сочетания методов разделения, направляемых биоанализом. В другом аспекте изобретение относится к применению полисахарида формулынастоящего изобретения в качестве лечебного средства при лечении иммуносупрессорных заболеваний, таких как рак, туберкулез, грипп, насморк, аллергии, красная волчанка, псориаз и СПИД. В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полисахарид формулы . Настоящая заявка включает представленные фигуры и таблицы. 3 10037 1 2007.12.30 Фигура 1 представляет собой схему выделения 2. Фигура 2 представляет собой схему выделения 2. Фигура 3 представляет собой спектр 1 Н-ЯМР 28. Фигура 4 представляет собой спектр 13 С-ЯМР 28. Фигура 5 представляет собой ТСХ продуктов гидролиза 28 ТФК и других моносахаридов. Фигура 6 представляет собой схему выделения 282, т.е., полисахарида формулы . Фигура 7 представляет собой профиль ВЭЖХ 282 с испарительным детектором светорассеяния. Фигура 8 представляет собой профиль ВЭЖХ 282 с фотодиодным УФдетектором. Фигура 9 представляет собой спектр 1 Н-ЯМР 282. Таблица 1 отражает действие образцов 28 и 282 на трансформацию лимфоцитов. Фигура 10 представляет собой спектр 13 С-ЯМР 282, т.е., полисахарида формулы . Фигура 11 представляет собой спектр -135 282. Фигура 12 представляет собой спектр -90 282. Фигура 13 представляет собой спектр 282. Фигура 14 представляет собой спектр 1-1- 282. Фигура 15 представляет собой спектр 1-1- 282. Фигура 16 представляет собой спектр 282. Таблица 2 отражает спектр 13 С-ЯМР 282. Фигура 17 представляет собой спектр НМВС 282. Фигура 18 представляет собой спектр НМВС 282. Фигура 19 представляет собой ТСХ продуктов гидролиза 282 ТФК и других моносахаридов. Фигура 20 представляет собой диаграмму измерения молекулярной массы. Как указывалось выше, в первом аспекте изобретение относится к полисахариду формулы . Схема 13- где 7 - 8. Конфигурационная структура соединения формулыотражается схемой . Схема 10037 1 2007.12.30 Полисахарид имеет молекулярную массу примерно 10000. Во втором аспекте изобретение относится к способу получения полисахарида формулы . Данный способ включает, во-первых, получение водного экстракта из растенияи, во-вторых, выделение полисахарида с использованием сочетания методов разделения, направляемых биоанализом. Предлагается способ получения полисахарида, включающий следующие стадии) обработку измельченного материала, полученного на стадии с) излучением красного линейного диодного лазера с длиной волны 150-810 нм, мощностью 1-60 Вт и диаметром луча 1-6 мм) суспендирование обработанного на стадии ) материала в воде) выдерживание суспензии, полученной на стадии е), для осуществления мацерации) лиофилизацию экстракта, полученного на стадии )) фракционирование метаном лиофилизованного вещества, полученного на стадии )) отделение твердой фазы от жидкой фазы) фракционирование твердой фазы, полученной на стадии ), растворами метанола с конечной концентрацией 25 , 50 и 67) растворение в воде преципитатов, полученных на стадии ). При фракционировании 50 и 67 раствором метанола) биоанализ для идентификации активной фракции о) хроматографическое разделение активной фракции) биоанализ для идентификации активной фракции) удаление элюента Очистку осуществляют, промывая цветкиводой. Количество воды, используемой на данной стадии, не определяется и может изменяться в зависимости от степени загрязнения растений. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура воды должна быть между 10 и 40 С, предпочтительно - между 20 и 35 С, и наиболее предпочтительно - 28 С. Можно использовать моечную камеру для облегчения данной стадии. Как количество воды, так и время пребывания растительного сырья в моечной камере не определяется и может, следовательно, изменяться в зависимости от степени загрязнения растений. Стадию промывки можно осуществлять несколько раз со стадией сушки в промежутках. Такую стадию сушки предпочтительно осуществлять, размещая растительное сырье на солнце. Как только цветки тщательно очищены, их измельчают обычными способами, такими как с применением машины для измельчения, или даже вручную. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой цветки измельчают,должна составлять от 10 до 40 С. Затем измельченные цветки подвергают обработке лазерным излучением. В качестве источника лазерного излучения используют предпочтительно красный линейный лазерный диод, способный генерировать излучение при длине волны в интервале 150-810 нм. Предпочтительно длина волны лазерного излучения составляет 200-400 нм, и наиболее предпочтительно - 250 нм. Мощность лазерного излучения составляет предпочтительно 1-60 Вт, предпочтительнее - 10-30 Вт и наиболее предпочтительно - 20 Вт. Пятно имеет диаметр предпочтительно 1-6 мм, предпочтительнее - 2-5 нм и наиболее предпочтительно 4 мм. На измельченное растительное сырье воздействуют лазерным излучением таким образом, чтобы облучалась вся смесь или ее большая часть. Этого достигают или перемещая вручную лазерный генератор в растительном сырье или пропуская измельченный материал 5 10037 1 2007.12.30 на ленточном конвейере через набор из нескольких лазерных генераторов. Предпочтительно каждый килограмм измельченного материала обрабатывают лазерным излучением в течение 3-10 минут, предпочтительнее - в течение 5 минут. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой измельченное растительное сырье обрабатывают лазерным излучением, должна составлять от 10 до 40 С. Затем обработанный лазерным излучением материал суспендируют в воде. На данной стадии можно использовать любую коммерческую минеральную воду. Суспендирование осуществляют таким образом, чтобы присутствовало 50-300, предпочтительно - 100-250,граммов обработанного лазером материала на литр воды. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой суспендируют измельченное растительное сырье, должна составлять от 10 до 40 С. Затем суспензию выдерживают в течение 5-25 суток, предпочтительно - 7-15 суток,при температуре от 2 до 10 С, предпочтительно - от 4 до 8 С, с тем, чтобы произошла мацерация. Наконец, после стадии мацерации осуществляют отделение жидкой фазы от твердой фазы. Отделения можно достичь одной декантацией или предпочтительно декантацией с последующей фильтрацией. Фильтрацию осуществляют предпочтительно под давлением. Наиболее предпочтительно осуществлять последовательно три фильтрации под давлением через фильтры 5 мкм, 1 мкм и 0,22 мкм. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой осуществляют отделение, должна составлять от 10 до 40 С. Наконец, получают водный экстракт коричневато-желтого цвета. Затем полученный экстракт подвергают процессу выделения, который включает осаждение метанолом, центрифугирование и хроматографическое разделение, направляемое биоанализом. Применяемый бионанализ осуществляют, добавляя образцы лимфоцитов, выделенных из крови мыши, согласно способу, описанному в литературе..,, . 54, . 6, . 1531-1542 (1991). Контролируют включение тимидина, что означает репликацию ДНК. Такое включение свидетельствует как о повышении числа лимфоцитов, так и о повышении активности лимфоцитов. Указанные используемые способы выделения включают повторное осаждение этанолом, центрифугирование, диализ и/или колоночную хроматографию. Таким образом, лиофилизуют 112 литров полученного предварительно водного экстракта и получают 800 г желтовато-коричневого порошка (2). Полученный порошок фракционируют на фракцию, растворимую в , и остаток, нерастворимый в(2, 350 г), который обнаруживает активность трансформации лейкоцитов. Часть (80 г) такого материала подвергают осаждению , центрифугированию, диализу и/или колоночной хроматографии на сефадексе , что ведет к выделению нескольких кристаллических веществ, которые определяют как неактивные неорганические соли (фиг. 1). Часть (270 г) 2, которую подвергают осаждениюдо конечных концентраций 25, 50 и 67 , приводит к активным преципитатам. Наиболее активным материалом является преципитат, полученный из 50 раствора(28, 51,2 г,1059 ). Обработка части в 5 г 28 путем растворения в воде с последующим центрифугированием и хроматографическое разделение супернатанта на сефадексе -25 приводит к активному полисахариду, обогащенному фракцией, названной 28 (0,13 г,1074 ). Затем из второй части (6 г) преципитата 50 получают 28 (0,3 г). Как показано на фиг. 2, выделяют ряд других фракций и кристаллических веществ, однако все они не показывают уровень активности 28. 28 характеризуют методами спектроскопии (спектры 1 Н-, 13 С-ЯМР и ) и химического анализа (гидролиз с ТФК и анализ методом ТСХ на силикагеле). См. фигуры 3, 4 и 5. 6 10037 1 2007.12.30 Более активную смесь полисахаридов 28 (1,4 г) выделяют из остального преципитата 50(28). В то же время обработка части (2,0 г) нерастворимой фракции 67 раствора(29735 ) приводит к выделению смеси полисахаридов (29, 0,3 г), которую анализом методом 1-ЯМР идентифицируют как 28. Поэтому 29 (0,2 г) объединяют с 28 (1,4 г), и смесь, названную 28, подвергают дальнейшему разделению на сефадексе -50 (20-80 мм), как показано на фиг. 6. Элюирование водой дает шесть фракций (281, 2, 3, 4, 5 и 6),анализ методом ВЭЖХ которых показывает, что только основной изолят 282 является гомогенным при детекции как с испарительным детектором светорассеяния, так и с УФ-детектором (фиг. 7 и 8). Спектральный анализ методами 1 Н- и 13 С-ЯМР (фиг. 9 и 10) дает спектры указанного изолята, которые весьма схожи со спектрами, полученными для 28 (фиг. 2 и 4), что предполагает, что он является основным полисахаридом в смеси. Следовательно, фракция 282 состоит из полисахарида формулыи воды. Последнюю можно удалить способами, известными в технике. Биоанализ гомогенного изолята 282 и исходной для него смеси 28 при таком же анализе показывает активность трансформации лейкоцитов 6203 и 3532 соответственно (табл. 1). Более высокий уровень активности, показанный изолятом, предполагает, что данный полисахарид является основной активной составляющей для биологического действия экстракта настоящего изобретения. Активный полисахарид 282 (полисахарид формулы ) характеризуют методами спектроскопии (спектры 1 Н-, 13 С-ЯМР,и 2 1 Н-1 Н ) и химического анализа(гидролиз с ТФК и анализ методом ТСХ на силикагеле). Так, сигналы 1 Н-ЯМР (фиг. 9) при 5,3 и 3,2 м.д. указывают на полисахарид. Сигналы 13 С-ЯМР (фиг. 10-12) при 111,9 (д),110,1 (д) м.д. приписываются аномерным углеродам 13, связанным с арабинофуранозой и концевой арабинофуранозой (обозначеннымиисоответственно). Сигналы при 106,1 (д) и 105,9 (д) приписываются аномерным углеродам 16,связанным с галактопиранозой, и 13, 16, связанным с галактопиранозой(обозначеннымиисоответственно), в то время как сигнал при 100,2 (д) м.д. приписывается аномерным углеродам рамнопиранозы (обозначенной ). Сигналы аномерных протонов (Н-1) также легко распознаются из-за их относительного слабопольного сдвига в спектрах 1 Н-ЯМР. Прямая корреляция междусиганалами протона и углерода-13 наблюдаемая в спектре(фиг. 13), определяет сигналы 1 Н-ЯМР 5,08 (ушс),5,23 (ушс), 4,47 (д,7,9 Гц), 4,53 (д,7,3 Гц) и 5,1 (ушс) м.д., соответствующие аномерным протонам арабинофуранозы ( ), арабинофуранозы , -галактопиранозыи рамнопиранозы . Используя указанные сигналы в качестве стандарта, можно обнаружить другие сигналы протонов, анализируя спектры 2 1-1(фиг. 14, 15). Подобным образом, по спектрамопределяют соответствующие сигналы углеродов (фиг. 13, 16 и табл. 2). Последовательность звеньев сахаров определяют следующим образом. Слабопольный сдвиг сигнала при С-3( 79,4) и( 82,8) и сигналы С-6 и( 69,2) предполагают, что указанные углероды связаны с другими углеводными звеньями. Наблюдение широкой корреляции между С-1 и С-6 ив спектре НМВС (фиг. 17) предполагает 16, связанный с главной цепью галактопиранозы. Из наблюдений широкой корреляции между С-1 и С-3(фиг. 18)является 13, связанным с . Из спектра 1 Н-ЯМР (фиг. 9) вычисляют соотношение сахаров согласно интеграционным величинам пиков аномерных протонов, соответствующее/ 31221. Поэтому 282 рассматривают как полисахарид с крупными боковыми цепями с первичной структурой,показанной формулой(схема ). Схемапредставляет ту же структуру, показывающую стереохимическую конфигурацию отдельных сахаров. 7 10037 1 2007.12.30 Для того чтобы подтвердить идентичность составляющих его сахаров, 282 гидролизуют с ТФК (0,5 М, 100-120 С), осуществляя затем анализ методом ТСХ (фиг. 19). Наличие основных сахаров арабинофуранозы и галактопиранозы легко устанавливается, в то время как наличие дополнительного сахара рамнопиранозы определяется труднее, вероятно, из-за количества гидролизата, наносимого на пластину для ТСХ. Молекулярную массу 282 оценивают методом гельпроникающей (по размеру) хроматографии. Средняя молекулярная масса 282, оцененная таким образом, составляет 10000 (фиг. 20). Полисахарид формулынеожиданно обнаруживает очень высокую активность как иммуностимулятор, что отражается в примерах, приведенных ниже. Третий аспект изобретения, таким образом, относится к применению полисахарида формулыпри лечении иммуносупрессорных заболеваний, таких как рак, туберкулез, грипп, насморк, аллергии,красная волчанка, псориаз и СПИД. Не являющимися ограничительными примерами раковых заболеваний являются рак печени, рак легких, рак почек, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак предстательной железы или аденокарцинома предстательной железы раковые заболевания головного мозга, такие как астроцитома и глиобластома рак шейки матки и рак мочевого пузыря. Четвертый аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим полисахарид формулы . Полисахарид по настоящему изобретению можно вводить или отдельно в виде чистого вещества или в форме фармацевтических препаратов, хотя предпочтительно соединение изобретения вводят в комбинированной форме. Комбинация лекарственного средства,предпочтительно, имеет форму композиции, которая (1) содержит один полисахарид по изобретению (2) содержит одно или несколько соответствующих связующих, носителей и/или вспомогательных веществ, и (3) может также содержать дополнительные терапевтически активные вещества. Носители, связующие вещества и/или вспомогательные вещества должны быть фармакологически переносимыми, с тем, чтобы их можно было комбинировать с другими компонентами композиции или препарата и не оказывать вредного действия на организм,который лечат. К таким композициям относятся композиции, подходящие для перорального и парентерального (в том числе, подкожного, интрадермального, внутримышечного и внутривенного) введения, хотя наилучший способ введения зависит от состояния пациента. Композиции могут находиться в форме однократных доз. Композиции получают согласно способам, известным в области фармакологии. Соответствующие количества активных веществ, подходящие для введения, могут изменяться как функция конкретной области терапии. Вообще концентрация активного вещества в композиции в форме однократной дозы составляет от 5 до 95 всей композиции. Применение изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. Получение водного экстракта цветковсогласно способу изобретения. Цветки(500 г) помещают в моечную камеру и подвергают промывке водой примерно 28 С. Затем цветки измельчают с помощью машины для измельчения. Полученные 500 г измельченного материала подвергают обработке излучением красного линейного лазерного диода, способного генерировать гармоники с длиной волны 250 нм, мощностью 20 Вт и диаметром пятна 4 мм. Обработку осуществляют вручную,перемещая лазерный генератор по измельченному материалу в течение 2,5 минут, так что облучается вся смесь или ее большая часть. Затем материал, обработанный лазером, суспендируют в 2 л воды при температуре примерно 20 С. Затем суспензию выдерживают в течение 12 суток при температуре 4 С. Наконец, осуществляют разделение жидкой и твердой фазы сначала декантацией жидкости (твердое вещество прессуют для облегчения 8 10037 1 2007.12.30 отделения) и затем последовательными тремя фильтрациями под давлением через фильтры 5,1 и 0,22 мкм при температуре примерно 20 С. Способ дает приблизительно 1,7 л раствора (водный экстракт) коричневато-желтого цвета. Пример 2. Выделение полисахарида формулыосуществляют так, как описывается ранее в описании. Пример 3. Полисахарид формулыиспытывают с целью определения его активности как иммуностимулятора, путем количественной оценки активности трансформации лейкоцитов . Под активностью трансформации лейкоцитов подразумевается тот факт,что лимфоциты переходят из пассивного состояния в активное, что необходимо для борьбы с болезнями через иммунологический механизм, или для восстановления иммунной системы, которую могли ослабить различные факторы. Испытания осуществляют согласно описанному в литературе способу ( ..,, . 54, . 6, . 1531-1542 (1991, добавляяраствор полисахарида изобретения к лимфоцитам, выделенным из организма мыши. Контролируют включение тимидина, что означает репликацию ДНК. Такое включение свидетельствует как о повышении числа лимфоцитов,так и о повышении активности лимфоцитов. Полисахарид формулыдает 6203 относительно нестимулированных лимфоцитов. Надписи на фигурах К с.1/21 Фигура 1. Направляемое биологической активностью фитохимическое выделение 2 Здесь и на сс.2/21 и 6/21- г,- преципитат (осадок), - остаток,- сефадекс,- маточная жидкость, - супернатант.- мг 1 - обработка Н 2 О, 2 - нерастворимый в Н 2 О, 3 - растворимый в Н 2 О,4 -до концентрации 50 , 5 - Кристаллы,6 - 2,6 г растворяют в 80 мл Н 2 О, 7 - 1,1 г растворяют в 1,5 мл Н 2 О,8 - Центрифугирование, 9 - Кубические кристаллы, 10 - Темный остаток,11 - Диализ в Н 2 О (2 суток), 12 - Диализат, 13 - Концентрированный раствор,14 - Диализ для удаления (4)2 О 3,15 -- активность трансформации лейкоцитов. К с.2/21 Фигура 2. Направляемое биологической активностью фитохимическое выделение 2- мл,- мкм,- мг,1 - 2 (х 3, перемешивание 2-4 часа), центрифугирование,2 - Концентрированный, 3 а - Добавлениедо 3 - центрифугирование, 4 - растворение в 2, центрифугирование,5 - элюирование 2, 6 - Промывка 2 7 - коричневый, 8 - Порошок (белый порошок), 9 - темно-коричневый,10 - собирают по 25 мл каждой фракции,11 - Концентрирование досуха, 12 - , затем промывка Н 2 О,13 - Растворяют в 4 мл 2, 14 - Фильтры, 15 - промывка Н 2 О,16 - Выпаривание при ,17 -- активность трансформации лейкоцитов. Кс.3/21 Фигура 3. Спектр 1 Н-ЯМР 28 (500 МГц, 2, относительно ) Здесь и далее- м.д. К с.4/21 9 10037 1 2007.12.30 Фигура 4. Спектр 13 С-ЯМР 28 (125 МГц, 2, относительно ) Кс.5/21 Фигура 5. ТСХ продуктов гидролиза 28 ТФК и других моносахаридов 1. Галактоза. 2 - Рамноза. 3. Продукты гидролиза 28. 4. Фруктоза. 5. Ксилоза. 6. Глюкоза. Кс.6/21 Фигура 6. Направляемое биологической активностью фитохимическое выделение активного полисахарида- мл,- мкм,1 - Н 2 О (х 3, перемешивание 2-4 часа), центрифугирование,2 - Концентрированный, 3 - Добавлениедо 4 - центрифугирование,5 - 2,0 г растворяют в 200 мл Н 2 О, перемешивают 15 мин, центрифугирование,6 - Концентрирование до 80 мл, 7 - элюирование Н 2 О,8 - Объединение с 8 из-за идентичности их ЯМР-спектров. Кс.7/21 1 - Хроматограмма, полученная автоматически 2 - Фигура 7. Профиль ВЭЖХ 82 с испарительным детектором светорассеяния(200, 250 х 8 мм, 5 мкм, 1,0 мл/мин, Н 2 О) 3 - Фигура 8. Профиль ВЭЖХ 82 с фотодиодным УФ-детектором (200, 250 х 8 мм, 5 мкм, 1,0 мл/мин, Н 2 О) Кс.8/21 Фигура 9. Спектр 1 Н-ЯМР 282 (500 МГц, 2, относительно ) Кс.9/21 Таблица 1 Действие образцов 28 и 282 на трансформацию лимфоцитов (самка мыши ) 10037 1 2007.12.30 Кс.18/21 Фигура 17. Спектр НМВС 282 (500 МГц, 2) Кс.19/21 Фигура 18. Спектр НМВС 282 (500 МГц, 2) Кс.20/21 Фигура 19. ТСХ продуктов гидролиза 282 ТФК и других моносахаридов 1 - -Галактуроновая кислота. 2 - Рамноза. 3. Галактоза. 4. Продукты гидролиза 28-2. 5 - Арабиноза. 6. -Глюкуроновая кислота. 7. -(-)-Фукоза. 8. силоза. 9. Глюкоза. 10. -(-)-Фруктоза. 11. Смесь продуктов гидролиза 28-2, арабинозы и галактозы. 12. -(-)-Манноза. 13. Смесь -ксилозы и арабинозы. Кс.21/21 1 - Измерение молекулярной массы 282 с использованием сефадекса -50 2 - Стандарт декстран 10500 3 - мол.масса 4 - Объем элюента 5 - Молекулярная масса 282 меньше 10500 6 - Фигура 20. Таблица 128252 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 19