Олигонуклеотид и способ ингибирования В-клеточной неоплазмы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Чанчунь Хуапу Биотекнолоджи Ко., Лтд.(73) Патентообладатель Чанчунь Хуапу Биотекнолоджи Ко., Лтд.(57) 1. Способ ингибирования роста В-клеток неоплазмы млекопитающего, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность 1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает индуцирование апоптоза В-клеток неоплазмы. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает увеличение экспрессии 40 на В-клетках неоплазмы. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает стимулирование продукции -10 В-клетками неоплазмы. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки лейкемии, В-клетки лимфомы или В-клетки множественной миеломы. 6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лейкемии представляют собой Вклетки хронической лимфоцитарной лейкемии. 7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лимфомы представляют собой Вклетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 8. Способ индуцирования апоптоза В-клеток неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность 1. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии. 10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии. 11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 12. Способ экспрессии 40 на В-клетках неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность 1. 15980 1 2012.06.30 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии. 14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии. 15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 16. Способ индуцирования продукции -10 В-клетками неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность 1 17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии. Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и фармакологии и предусматривает получение олигонуклеотида с последовательностью, которая представлена в 1, или его функционального гомолога для ингибирования Вклеточной неоплазмы (опухоли) млекопитающего, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, который вызывает апоптоз (гибель) Вклеток неоплазмы (опухоли), улучшает экспрессию 40 на В-клетках неоплазмы и индуцирует В-клетки неоплазмы для воспроизведения -10. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог может использоваться один либо в комбинации с химиотерапией,иммунотерапией и облучением для ингибирования В-клеточной неоплазмы млекопитающего. В соответствии с системой классификации ВОЗлимфоидная злокачественность группируется на три основных класса В-клеточную неоплазму, Т-клеточную неоплазму (естественные киллеры -клеток) и лимфому Ходжкина. В-клеточная неоплазма также делится на две группы предшественники В-клеточной неоплазмы и периферическая В-клеточная неоплазма. Предшественники В-клеточной неоплазмы включают в себя предшественники В-клеточной острой лимфобластной лейкемии (В-клеточная острая лимфобластная лейкемия, -)/ лимфобластная лимфома . Периферическая В-клеточная неоплазма включают в себя В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (-), малую лимфоцитарную лимфому, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, лимфоплазматическую лимфому/иммуноцитому, -клеточную лимфому,фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую Вклеточную маргинальную зону лимфомы типа , узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны ( /- моноцитоид В-клеток), лимфому селезеночной маргинальной зоны ( /- ворсинчатые лимфоциты), волосатоклеточную лейкемию, плазмоцитому/плазмоклеточную миелому, диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную Вклеточную лимфому, интраваскулярную крупноклеточную В-лимфому, первичную лимфому и лимфому Беркитта 1. Хроническая В-клеточная лимфоцитарная лейкемия (-) и В-клеточная острая лимфобластическая/лимфоцитарная лейкемия (-) являются двумя типами Вклеточной лейкемии.- клетки экспрессируют 19, 5 и 23 ( , . .,.2005352804-15). - клетки экспрессируют 1910 маркеры. Мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома является В-клеточной неоплазмой. Моноклональная популяция В-клеток в мелкоклеточной лимфоцитарной лимфоме экспрессирует 19, 5 и 23 2. Диагностирование В-клеточной неоплазмы обусловливает выбор текущего лечения,которым является химиотерапия, лучевая терапия и иммунотерапия. 40, экспрессируемая на клеточной поверхности нормальных В-лимфоцитов и дентрических клеток, при 2 15980 1 2012.06.30 надлежит к группе рецептора фактора некроза опухоли . 40 (154), экспрессируемая на Т-лимфоцитах, принадлежит к группе фактора некроза опухоли. Взаимодействие 40 и 40 способствует пролиферации, дифференциации и антигенной презентации В-лимфоцитов, дентрических клеток и моноцитов. 40 также экспрессирует на В-клетках неоплазмы. Экспрессия 40 вызывает апоптоз неопластических В-клеток. Эксперименты как, так ипоказали, что экспрессия 40 вызывает подавление роста В-клеток неоплазмы. Известно, что экспрессия 40 на неопластических В-клетках усиливает антигенность неопластических В-клеток и, следовательно, стимулирует производство специфических к этим клеткам цитотоксических -лимфоцитов .могут эффективно убивать В-клетки неоплазмы. При наличии 40 В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, на которых экспрессирует 40, могут быть убиты 4 цитотоксическими Тлимфоцитами. Взаимодействие между 40 и 40 на клетках лимфомы Буркетта может провоцировать клетку на презентирование опухолевых атигентов специфических . Экспериментыи клинические исследования показали, что активация 40 может улучшать иммуногенность клеток хронической В-клеточной лимфоцитарной лейкемии(-) и, следовательно, индуцировать воспроизведение , специфических этим клеткам. В то же время экспрессия 40 на неопластических В-клетках может стимулировать антиопухолевый иммунитет по отношению к В-клеточной неоплазме. Антиопухолевый иммунитет включает, но не ограничивается следующим 1) стимулирование апоптоза неопластических В-клеток 2) подавление роста неопластических В-клеток 3) усиление иммуногенности В-клеток неоплазмы и, следовательно, стимулирование воспроизведения , специфических этим клеткам. Интерлекин-10 (-10) является гомодимером цитокина, продуцируемым некоторыми-клетками, моноцитами, макрофагами и некоторыми неопластическими клетками, проявляющимся в В-клетках, -клетках или -клетках. Активность -10 опосредуется специфическими поверхностными клеточными рецепторами. Рецептор экспрессируется на антиген-презентирующих клетках, лимфоцитах, а также В-клетках хронической лимфоцитарной лейкемии (-). Добавление экзогенной -10 ингибирует разрастание клеток, свежевыделенных от больных. Известно, что -10 ингибирует разрастание - клеток и усиливает апоптоз клеток 3. Иммуностимулирующие антираковые свойства -10 обсуждаются в обзоре, в котором делается предположение о том, что избыточная экспрессия -10 в опухолевом микроокружении может катализировать раковое иммунное отторжение 4. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в создании способа ингибирования В-клеток неоплазмы млекопитающего, индуцирования апоптоза В-клеток неоплазмы, увеличения экспрессии -10 в опухолевом микроокружении и стимулирования продукции -10 В-клетками неоплазмы. Поставленная задача решается предлагаемым способом, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность 1. Олигонуклеотид индуцирует апоптоз В-клеток неоплазмы, способствует экспрессии 40 на поверхности неопластических В-клеток и стимулирует образование-10 в неопластических В-клетках. Сущность изобретения. В первом примере осуществления (изобретения) настоящее изобретение предусматривает олигонуклеотид с последовательностью (рассчитанный как -2 или обозначенный 1) или его функциональный 3 15980 1 2012.06.30 гомолог. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог может иметь модификацию фосфатной цепи, которая проявляется в частичной или полной модификации фосфоротиата или фосфородитиата. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог может иметь химические модификации или иметь замещения на. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог может быть функциональной частью любого другого олигонуклеотида или фрагментом ДНК или быть клонированным в плазмид, бактериальный вектор, вирусный вектор или вакцину ДНК соответственно. Олигонуклеотид с последовательностью 1 может быть модифицирован путем добавления одного или двух оснований (предпочтительнее от 1 до 10 оснований) к концу каждого олигонуклеотида или заменой оснований в нем. Специалисты могут определить использование олигонуклеотида с последовательностью 1 или его функционального гомолога, или фрагмента ДНК, однократно или двукратно скрученного, содержащего в себе одну или более копий олигонуклеотида с последовательностью 1, для достижения цели изобретения. Во втором примере осуществления (изобретения) настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеточной неоплазмы млекопитающего с использованием олигонуклеотида или его функционального гомолога в объекте исследования. Объектом является человек или животное. В-клеточная неоплазма включает, но не ограничивается В-клеточной лейкемией, В-клеточной лимфомой или миеломой. В третьем примере осуществления (изобретения) настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеточной неоплазмы млекопитающего с использованием олигонуклеотида или его функционального гомолога путем индуцирования апоптоза Вклеток неоплазмы. В четвертом примере осуществления (изобретения) настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеточной неоплазмы используя олигонуклеотид или его функциональный гомолог путем экспрессии 40 на В-клетке неоплазмы. В пятом примере осуществления (изобретения) настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеточной неоплазмы используя олигонуклеотид или его функциональный гомолог путем продукции -10 неопластическими В-клетками. В остальных примерах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеток неоплазмы, заключающийся в контактировании В-клеток неоплазмы с эффективным количеством олигонуклеотида или его функционального гомолога по данному изобретению. Способ иллюстрирован на фиг. 1-7. Фиг. 1 - апоптоз клеток - индуцированных -2 (дозирование). Клетки - были выращены в 10 субстрате человеческой сывороткис или без добавления различного количества -2. На 7-й день клетки были окрашены . Количество жизнеспособных клеток - выражалось в проценте -положительно окрашенных клеток. Фиг. 2 - влияние -2 на экспрессию 40 на клетке -. Клетки - инкубировались с или без -2 в течение 7 дней и затем были окрашены с помощью -40 антител для анализа экспрессии 40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указывается с помощью показателей . Фиг. 3 - влияние -2 на экспрессию 40 на клетке мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы инкубировались с или без -2. На 7-й день клетки были окрашены с помощью -40 антител для анализа экспрессии 40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указывается с помощью показателей . Фиг. 4 - апоптоз - клеток, индуцированных -2. 15980 1 2012.06.30 Клетки - инкубировались с или без -2. На 3, 5 и 7-й дни инкубации клетки были окрашены с помощьюдля последующего цитофлоуметрического анализа. Число жизнеспособных клеток - выражалось процентом -позитивно окрашенных клеток. Фиг. 5 - экспрессия 40 в клетке - с помощью -2. Клетки - были культивированы с или без раствора -2 в концентрации 1 /. На 3, 5 и 7-й дни культивирования клетки были окрашены с помощью маркированных анти-С 40 для анализа экспрессии 40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указывается с помощью показателей . Фиг. 6 - выработка интерлекина-10 - клетками, индуцированная -2. Клетки - культивировались с или без 1 / -2 в бессывороточной питательной среде. Супернатанты были собраны в указанное время с определением -10 с использованием набора . Фиг. 7 - влияние -2 на пролиферацию обычной человеческой . Обычные человеческиекультивировались с -2-2, 2216 или 2006 в течение 36 часов и затем клеточная пролиферация была оценена по инкорпорации 3 меченого тимидина. Были исследованы 5 образцов крови. Разрастание клеток было выражено как 1. Подробное описание изобретения. Олигонуклеотид согласно изобретению представляет собой множество нуклеотидов(например, молекулы, содержащие сахар (например, дезоксирибоза), связанные с фосфатной группой и взаимозаменяемой органической основой). Существует четыре органических основания цитозин , тимин , аденини гуанин . Олигонуклеотид можно синтезировать с помощью автоматического синтезатора олигонуклеотида, который может быть доступен на рынке, или может быть приготовлен из имеющихся последовательностей нуклеиновых кислот используя известный метод. Аолигонуклеотида означает, что олигонуклеотид имеет фосфороциатно модифицированную фосфатную часть(например, по крайней мере один из кислородов фосфата замещается серой) или другой модифицированный. Химическая модификация олигонуклеотида означает модификацию путем использования активных групп нуклеотида или создание аналогов нуклеотида. Модификации могут иметь место или в течение, или после синтеза олигонуклеотида. Во время синтеза модифицированные основания (включающие, но не ограничивающиеся аналогами тимидина) могут быть встроены внутрь или к 5 окончанию. После синтеза модификация может быть проведена с использованием активных групп (посредством амино-модификатора или 35 гидроксильной группы, или через фосфатную группу). В-клеточная неоплазма означает заболевание, развивающееся вследствие патологической пролиферации клеток В-лимфоцитарного ряда. В-клеточная неоплазма может быть подразделена на В-клеточную лейкемию, В-клеточную лимфому и миелому (плазмоцитома/плазмоклеточная миелома). В-клеточная лейкемия включает В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (-), острую лимфобластную лейкемию (Впредшественник) (В-клеточная острая лимфоцитарная лейкемия (-, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию и волосатоклеточную лейкемию. В-клеточная лимфома включает мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому/ иммуноцитому, -клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны типа ,узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны (/- моноцитоидных В-клеток), лимфому селезеночной маргинальной зоны (/- ворсинчатые лимфоциты), диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-лимфому,внутрисосудистую крупноклеточную В-лимфому, первичновыпотную лимфому и лимфомы Беркитта. 5 15980 1 2012.06.30 Объект означает млекопитающее, включающее, но не ограничивающееся человеком,обезьяной, собакой, кошкой, лошадью, коровой, свиньей, козлом, овцой, мышью и крысой. Олигонуклеотид изобретения может быть введен объекту с В-клеточной неоплазмой. Фактор анти-В-клеточной неоплазмы означает фактор, используемый при леченияи Вклеточной неоплазмы в объекте. Фактор включает олигонуклеотид данного изобретения,химиотерапевтические, иммуннотерапевтические средства и средства, используемые в радиотерапии. Олигонуклеотид данного изобретения может быть назначен до, во время или после (предварительно, вместе или после) введения одного или более антинеопластических агентов для достижения синергического эффекта при лечении В-клеточной неоплазмы. Химиотерапия означает химиотерапию В-клеточной неоплазмы в сочетании с олигонуклеотидом данного изобретения. Олигонуклеотид данного изобретения может быть использован с одним или более химиотерапевтическими средствами для ингибирования Вклеточной неоплазмы. Химиотерапия включает, но не ограничивается алкилирующими агентами, такими как циклофосфамид или хлорамбуцил, алкалоид Барвинка (например,винкристин и винбластин), прокарбазин, метотрексат, преднизон, антрасициклин, аспарагиназа, пуриновые аналоги (например, флюдарабин монофосфат, 2-хлородеоксиаденозин и пентостатин), цитозин, арабиносид, цисплатина, этопозид и ифосфамид. Олигонуклеотид данного изобретения также может использоваться с одной или более химиотерапевтическими комбинациями. Комбинации включают, но не ограничиваются(циклофосфамид, винкристин и преднизон),( и доксорубицин), - (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбазин), - ( плюс прокарбазин и блеомицин), - ( плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин),(преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандартный ), - (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкристин, метотрексат андлеуковорин),(метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, фиксированная доза преднизона, блеомицин и лейковорин), -16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид),(метил-гаг, ифосфамид, метотрексат андетопосид),(дексаметазон, высокая доза цитарабина и цисплатина),(этопозид, метилпредизолон,цитарабин, цисплатин), (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин),(ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон),плюс блеомицин, метотрексат,прокарбазин, нитроген мустард, цитозин арабиносид и этопосид,(меклетамин( циклофосфамид, доксорубицин, преднизон). Термин иммунотерапевтические средства означает иммунотерапевтические средства для ингибирования В-клеточной неоплазмы в комбинации с олигонуклеотидом данного изобретения. Олигонуклеотид данного изобретения может использоваться с одним или более иммунотерапевтическими средства для ингибирования В-клеточной неоплазмы. Иммунотерапевтические средства включают, но не ограничиваются антителами-20. Антитело 20 включает иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфично взаимодействуют с протеином 20 на клеточной поверхности неопластической В-клетки. Антитела 20 могут быть поликлональными и моноклональными антителами, гибридными антителами, - антителами иантителами. 20 являются Вклеточными мембранными протеинами, экспрессируются как нормальными, так и неопластическими В-клетками. Терапевтически эффективное количество олигонуклеотида данного изобретения относится к дозе, которая используется для достижения желаемого результата ингибирова 6 15980 1 2012.06.30 ния В-клеточной неоплазмы в объекте исследования. Доза может определяться с помощью стандартной методики, хорошо известной специалистам, и может варьировать в зависимости от факторов, которые включают, но не ограничивают объем или/и общее состояние субъекта или тяжести заболевания. Примеры выполнения способа. Нижеприведенные примеры являются пояснительными и не должны ограничивать объем данного изобретения. Целесообразные вариации, которые относятся к целесообразным мелким производителям, могут быть сделаны без отклонения от объема изобретения. Пример 1. Синтез олигонуклеотида. Олигонуклеотид с последовательностью 53 (разработанный как -2,1) может быть разработан и синтезирован. Для анализа функций -2 были синтезированы два контрольных олигонуклеотида 2006 с последовательностью 53 (2) и 2216 с последовательностью 5-3 (3). Три олигонуклеотида были синтезированы в(, ), проверены на эндотоксичность с помощью лизата(, ) и были превращены в апирогенные реагенты, Олигонуклеотид 2006 является хорошо изученным олигонуклеотидом, который интенсивно активизирует нормальные В-клетки. Олигонуклеотид 2216 является еще одним хорошо изученным олигонуклеотидом, который индуцирует высокий уровень количества интерферона типав дентрических плазмоцитоидных клетках. Методы синтезирования олигонуклеотида хорошо известны специалистам, и, наряду с другими, обычно используют твердофазный синтез . В качестве твердого носителя используется пористое стекло с определенным размером гранул. Эти гранулы имеют поверхность с отверстиями и каналами, и это дает возможность прикрепиться защищенному нуклеотиду. Синтез олигонуклеотида начинается с 3- нуклеотида и протекает через серию циклов, составляющих 5 шагов, которые повторяются до тех пор, пока не прикрепится - нуклеотид. Этими шагами являются депротекция, активация, сцепление, закрытие и стабилизация. Шаг 1. Депротекция. Защитная группа в охраняемом нуклеозиде, прикрепленном к грануле, удаляется при помощи трихлоруксусной кислоты, оставляя реактивную 5 гидроксильную группу. Шаг 2. Активация. На данном шаге тетразол действует на сцепленный фосфорамидит нуклеозид, формируя промежуточную форму - тетразолил фосфорамидит. Шаг 3. Сцепление. Промежуточная форма тетразолил фосфорамидита взаимодействует с гидроксильной группой реципиента и образует связь между 5 и 3. В результате восстанавливается тетразол и процесс продолжается. Шаг 4. Закрытие. На данном шаге ацетилирующий реагент, состоящий из уксусного ангидрида и метил имидазола, используется для блокирования реактивной гидроксильной группы на 5- конце олигонуклеотида для предупреждения последующей ошибки сцепления. Шаг 5. Стабилизация. Как только завершается этап (шаг) закрытия, последним шагом в цикле является оксидация, которая стабилизирует фосфатную связь между растущей цепью олигонуклеотида и последним добавленным основанием. Данный шаг проводится в присутствии йода как слабого оксиданта в тетрагидрофуранеи воде. Если придерживаться данного последнего шага, то идет повторение цикла для каждого нуклеотида в последовательности. 15980 1 2012.06.30 По окончании синтеза одиночно скрученная молекула ДНК очищается с помощью таких методов, как , , , 18 и . Пример 2. Апоптоз человеческих - клеток, индуцированных -2. 1. Подготовка человеческих - клеток. Были отобраны образцы крови у нелеченных - (патологически идентифицированных) больных (,, ) после получения письменного подтверждения согласия. Периферические мононуклеарные клетки кровибыли изолированы путем центрифугирования в градиенте плотности - . Клетки 51923- в периферических мононуклеарных клетках крови были очищены с помощью В-клеточного изолирующего набора ( , , ) с содержанием 51923(- ) более 95 . Клеточный препарат был приготовлен по руководству. Пример 3. Апоптоз человеческих - клеток, индуцированных -2. Клетки - инкубировались с -2 или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 (способ)в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2, 2006 или 2216 были разбавлены в сывороточной среде 1640 . Такой же объем был использован в качестве контрольного. На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира ( ,.. 279, . 23,4, . 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. -положительные (жизнеспособные) и -отрицательные(апоптические) - клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Номер жизнеспособной - клетки был определен путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на десяти образцах крови от - больных и общий результат показал (10), что -2 значительно индуцирует апоптоз - клеток(табл. 1) и эффект, индуцированный -2, получается приблизительно в два раза более сильный, чем тот, что был индуцирован 2006. Кроме того, был также замечен эффект дозазависимости -2 и 2006 на апоптоз - клеток. Результат показал, что -2 в различных дозах, варьируемых от 0,1-10 /, явно индуцирует апоптоз - клеток(фиг. 1). Для сравнения в дозе в 1 / апоптоз, индуцирующий эффектом -2, является приблизительно в три раза сильнее, чем тот, что был индуцирован 2006. Таким образом, данные результаты показывают, что -2 может быть использован для ингибирования - путем индуцирования апоптоза - клеток. Таблица 1 Апоптоз - клеток индуцированных -2-(10)-2 45,59,5 17,65,6 14,23,1 Табличные надписи Жизнеспособные - клетки(10). Гппа Среда Время инкубации (дни) 8 15980 1 2012.06.30 Пример 4. Экспрессия 40 на человеческих - клетках с помощью -2. 1. Приготовление человеческих - клеток. Человеческие - клетки были изъяты у - больных с помощью процедуры,описанной в примере 2. 2. Экспрессия 40 на человеческих - клетках с помощью -2.- клетки инкубировались с -2 или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2, 2006 или 2216 были разведены бессывороточной средой 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контрольный . На седьмой день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью антител -40 ( )( ,.. 279, . 23,4, . 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. - клетки, окрашенные антителами к 40, были обнаружены с помощью проточной цитометрии (. .). Результат (фиг. 2) показывает, что -2 значительно увеличивает экспрессию 40 на - клетке, свидетельствуя о том, что -2 может использоваться для ингибирования - путем увеличения 40 на клетках. Увеличение количества 40 вызывает апоптоз - клеток, приводит к ингибированию роста - клеток и приводит - клетки в более иммуногенное состояние для стимуляции размножения ,специфических для - клеток. Эксперимент был повторен как минимум на десяти образцах крови от - больных с похожими результатами. Пример 5. Продуцирование -10 из -, индуцированных -2. 1. Подготовка человеческих - клеток. Человеческие - клетки были взяты у - больных с помощью процедур, описанных в примере 2. 2. Продукция -10 клетками -, индуцированными -2.- клетки были культивированы с -2 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48 луночной плашке в трех экземплярах. -2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . Супернатант культуры был собран через 72 часа или в заданное время и оценен на предмет -10 в системе( ). Наши данные показали, что -2 инициирует продукцию до высокого уровня -10 - клетками (фиг. 6). Выраженное увеличение продукции -10 было выявлено через 6 часов, достигало максимума через 24 часа и оставалось на высоком уровне более 72 часов. Кроме того, наши данные впоследствии показали, что добавление экзогенного 10 ( ) в культуру - клеток индуцировало апоптоз - клеток дозазависимым от -10 способом, который мог быть специфически блокирован антителами -10 ( ). Данные результаты исследования показали,что -2 может использоваться для ингибирования - путем индуцирования продукции -10, которое провоцирует апоптоз - клеток аутокринным способом. Эксперимент был повторен с использованием, по крайней мере, десяти образцов, изъятых у больных. Пример 6. Апоптоз клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванных-2. 1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были выделены путем биопсии лимфотического узла от больных (,, ) с мелкоклеточ 9 15980 1 2012.06.30 ной лимфоцитарной лимфомой (патологически идентифицированной) после получения информированного письменного согласия. Биоптат был измельчен с помощью шероховатой поверхности предметного стекла для выделения клеток в 510 человеческойсывороточной среде 1640 в 6-сантиметровую плашку для культивирования. Отделенные клетки были профильтрованы через ячею нержавеющей стали и собраны в 50 коническую пробирку, содержащую 15 бессывороточной среды 1640. Пробирка была центрифугирована при 300 в течение 10 минут и затем надосадочная жидкость была слита. 51923 клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были очищены с использованием изоляционного комплекта (,, ) до содержания 51923 клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы более 95 . Клеточный препарат был сделан по руководству. 2. Апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванных -2. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы инкубировались с помощью -2 или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2,2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира ( ,(апоптические) - клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Число жизнеспособных - клеток было рассчитано путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на пяти образцах, изъятых у больных с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой, и общий результат (5) показал, что -2 значительно индуцирует апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (табл. 2),свидетельствует о том, что -2 может быть использован для ингибирования мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем индуцирования апоптоза клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Таблица 2 Апоптоз мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы индуцированной -2(5) Жизнеспособные мелкие клетки лимфоцитарной лимфомы(5) Группа Среда Время инкубации (дни) Пример 7. Влияние -2 на экспрессию 40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 10 15980 1 2012.06.30 Клетки человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были изъяты у больных с помощью методов, описанных в примере 4. 2. Влияние -2 на экспрессию 40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были инкубированы с -2 или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль. На седьмой день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с антителом-40 ( ) ( ,.. 279, . 23,4, . 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, окрашенные антителом 40,были детерминированы с использованием проточной цитометрии (. .). Результат (фиг. 3) показал, что -2 значительно увеличивает экспрессию 40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, показывая, что -2 может использоваться для лечения мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем экспрессии 40 в клетках. Экспрессия 40 стимулирует апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, индуцирует угнетение роста клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы и приводит клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы в более иммуногенное состояние для стимулирования генерации специфических для этих клеток . Эксперимент был повторен на 5 образцах с похожими результатами. Пример 8. Апоптоз клеток человеческой острой В-клеточной лимфобластной/лимфоцитарной лейкемии, индуцированных -2. 1. Подготовка человеческих - клеток. Были изъяты образцы крови от необработанных - (патологически идентифицированных) больных (,, ) после получения информированного письменного согласия.были изолированы с помощьюцентрифугирования в градиенте плотности. 1910- клетки вбыли очищены с использованием В-клеточного изолирующего набора (,, ) до содержания 1910 клеток (- клетки) более 95 . Подготовка клетки осуществлялась в соответствии с руководством- клетки были инкубироавны с -2 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира ( ,.. 279, . 23,4, . 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. -положительные (жизнеспособные) и -негативные (апоптические) - клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Число жизнеспособных - клеток было рассчитано путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Результат показал, что -2 значительно индуцирует апоптоз - клеток (фиг. 4), и показывает, что -2 может быть использован для лечения - путем индуцирования апоптоза - клеток. Эксперимент был проведен на десяти образцах крови, взятых у больных, с получением подобных результатов. 11 15980 1 2012.06.30 Пример 8. Экспрессия 40 на - клетках при -2. 1. Подготовка человеческих - клеток. Человеческие - клетки были подготовлены из образцов крови больных с помощью процедур, описанных в примере 6. 2. - клетки были инкубированы с -2 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. -2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью -40 антител ( ) ( ,.. 279, . 23,4, . 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. - клетки, окрашенные с помощью антител 40, были детерминированы с помощью проточной цитометрии (. .). Результат (фиг. 5) показал, что -2 значительно увеличивает экспрессию 40 на - клетке, показывая, что -2 может быть использован для лечения - путем экспрессии 40 на клетках. Экспрессия 40 способствует апоптозу - клеток,индуцируя ингибирование - клеток, и приводит - клетки в более иммунногенное состояние для стимулирования генерации , специфических для - клеток. Эксперимент был проведен на десяти образцах крови, взятых у больных, с получением таких же результатов. Пример 9. Эффект -2 на человечески нормальную РВМС пролиферацию. Человеческиебыли изолированы от лейкоцитарного слоя нормальной донорской крови (, ) с помощью центрифугирования градиента плотности - . Жизнеспособностьсоставляла 9599 по методу вытеснения трипаново синего.(6105/) были размещены в 96-луночной плошке с -образным дном и культивированы с или без -2 (6 /) в трех экземплярах в течение 36 часов с последующей обработкой 3 тимидином (, , ) в течение 16 часов. Клетки были собраны на стекловолоконных фильтрах и измерены сцинтилляционным счетчиком. Пролиферация клеток была выражена через() (из трех лунок). Были представлены данные от 5 нормальных образцов крови. 2006 и 2216 были использованы как контроль. Результаты показали, что -2 может отчетливо стимулировать пролиферацию(фиг. 7), показывая, что -2, вместо индуцирования апоптоза, стимулирует пролиферацию нормальных человеческихи не токсичен для культивированных клеток. На основании детального описания изобретения и в соответствии с его реализацией(воплощением) специалисту в соответствующей области будет очевидно, что модификации и вариации возможны без выхода за рамки данного изобретения. Источники информации 1. Классификация ВОЗ ,. - 1997. - . 21 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 14