Способ оценки клеточной сенсибилизации организма

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА(71) Заявитель Белорусский научно-исследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(73) Патентообладатель Белорусский научноисследовательский институт радиационной медицины МЗ РБ(57) Способ оценки клеточной сенсибилизации организма, включающий стимуляцию культуры лейкоцитов периферической крови антигеном и определение количества лифмоцитов, несущих специфические рецепторы в реакции розеткообразования в контрольной и опытной культурах, отличающийся тем, что стимуляцию осуществляют не менее 16 часов, а затем определяют количество лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 с помощью частиц, нагруженных рекомбинантным интерлейкином 2, и при получении соотношения между опытом и контролем 5 и более определяют сенсибилизацию организма. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для характеристики клеточной сенсибилизации организма к экзогенным и эндогенным антигенам. Для оценки клеточной сенсибилизации организма применяют целый ряд методов основанных на оценке продукции биологически активных веществ (цитокинов) под влиянием специфического стимула оценке функциональной активности лимфоидных клеток после стимуляции их культуры специфическим антигеном морфологическом изучении лимфобластов, индуцируемых антигеном. Наиболее близким решением, выбранным в качестве прототипа, является способ морфологического учета реакции бластной трансформации. Лимфоциты сенсибилизированного организма в присутствии специфического антигена в культуре клеток в течение не менее чем 5 суток, переходят в бластные формы, которые регистрируются при специальном окрашивании в световом микроскопе 1. Описанный способ имеет следующие недостатки 1) требование дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала, абсолютной стерильности 2) обязательное использование дорогостоящих, высококачественных сред для культивирования, сохраняющие жизнеспособность лимфоцитов, не менее 5-7 суток 3) значительная вариация результатов, которая связана с длительностью инкубации культуры лимфоцитов и значительной долей субъективизма при морфологическом учете бластных форм 4) сроки культивирования составляют 5 суток и более, что существенно снижает диагностическое значение теста для конкретных пациентов 5) трудоемкость морфологического учета бластных форм. 2744 1 Общими с прототипом признаками являются 1) техника культивирования лейкоцитов периферической крови (забор крови, антигены, постановка опытной и контрольной культур и т.д.) 2) морфологический учет результатов реакции 3) вынесение суждения о сенсибилизации по разнице между результатами опытной и контрольной культурами. Задачей изобретения является сокращение времени проведения реакции, которая решается следующим образом. Заявляемый способ основан на оценке ранних активационных маркеров (рецепторы к интерлейкину 2) в краткосрочной культуре лимфоцитов. Для этого получают венозную кровь, с гепарином (20 Ед/мл) в качестве антикоагулянта отстаивают при 37 С и плазму со взвешенными лейкоцитами разводят средой 199 (гентамицин - 1 мг/мл) в соотношении 15 (концентрация лейкоцитов 1-2106/мл). Разведенную средой 199 плазму с лейкоцитами объемом 1,0-2,0 мл на одну культуру (из расчета 2,00,5 млн. лейкоцитов) вводят в стерильные пенициллиновые флаконы, в опыт добавляют испытуемый антиген (в заранее подобранных нетоксичных концентрациях), в контроль - такое же количество раствора, на котором готовится разведение антигена. Газовую среду насыщают углекислотой, флаконы герметически закупоривают и помещают в термостат при 37 С не менее, чем на 16 часов. Затем отмывают забуференным физиологическим раствором и оценивают способность к розеткообразованию с частицами, несущими ИЛ 2. Диагностику для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2, готовят следующим образом эритроциты быка отмывают забуференным физиологическим раствором до исчезновения в супернатанте следов белка. 1 мл эритроцитов,упакованных центрифугированием (1000 об/мин., 15 мин.), смешивают с 2,5 раствором глютарового альдегида в общем объеме 20 мл. Инкубируют 24 часа при 4 С с периодическим встряхиванием и отмывают от глютарового альдегида. Препарат рекомбинантного интерлейкина 2 (рИЛ 2) разводят в 1,0 мл дистиллированной воды и добавляют к осадку эритроцитов, после чего ресуспендируют и инкубируют 24 часа на холоде. Непрореагировавшие альдегидные группировки блокируют 0,1 раствором человеческого сывороточного альбумина. Хранят в осажденном состоянии в присутствии 0,1 азида натрия срок хранения препарата без потери активности - 6 месяцев. Число мононуклеаров в аликвотах культур клеток доводят до концентрации 2-3106/мл диагностикум до 50-75106 частиц/мл.В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл суспензии клеток и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150 . Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкп 0,05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 790 и масляную иммерсию, оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов. Пример 1. Больной Т., 32 года. Клинический диагноз Бронхиальная астма, атопическая форма, средней тяжести,ДНО. Сенсибилизация к аллергену домашней пыли. Венозную кровь с гепарином (20 Ед/мл) отстаивают при 37 С и плазму со взвешенными лейкоцитами разводят средой 199 (гентамицин 1 мг/мл) в соотношении 15 (концентрация лейкоцитов составила 1106/мл). Плазму с лейкоцитами объемом 2,0 мл вносят в 2 стерильных пенициллиновых флакона, в один из которых добавляют аллерген домашней пыли (0,2 мл, 100 /мл), а в другой - 0,2 мл разводящей жидкости. Газовую среду насыщают углекислотой, флаконы герметически закупоривают и ставят в термостат при 37 С на 16 часов. Затем отмывают забуференным физиологическим раствором (2,0 мл на культуру, дважды). К осадку клеток добавляют 0,2 мл забуференного физиологического раствора число лимфоцитов составило 2,5106/мл диагностикум для определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 приготовленный, как описано выше - разводят до 60106 частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лимфовзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 С, после чего центрифугируют при 150 . Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 50 мкл 0,05 раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азурэозином. Используя увеличение 7 х 90 и масляную иммерсию, оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов в контрольной культуре он составил 8 , в стимулированной аллергеном - 15 . Разница между опытной и контрольной культурами - 7 , из чего выносят суждение о наличии сенсибилизации организма к аллергену домашней пыли. Таким образом, предложенный способ позволяет оценивать клеточную сенсибилизацию организма его преимущества перед традиционными следующие 1) укорочение сроков культивирования в 8 раз и повышение, благодаря этому, точности определения клеточной сенсибилизации, т.к. исключается влияние вариаций качественного и количественного состава среды культивирования 2744 1 2) более низкие требования к качеству оборудования, квалификации персонала, стерильности 3) меньшая вариабельность результатов 4) простота учета результатов 5) широкие возможности, по сравнению с реакцией бластной трансформации лимфоцитов, использования в рутинной клинико-лабораторной практике. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3