Олигонуклеотиды и способ ингибирования В-клеточной неоплазмы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Чанчунь Хуапу Биотекнолоджи Ко., Лтд.(73) Патентообладатель Чанчунь Хуапу Биотекнолоджи Ко., Лтд.(57) 1. Способ ингибирования роста В-клеток неоплазмы млекопитающего, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из 1-9. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает индуцирование апоптоза В-клеток неоплазмы. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает увеличение экспрессии-40 на В-клетках неоплазмы. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает стимулирование продукции -10 В-клетками неоплазмы. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки лейкемии, В-клетки лимфомы или В-клетки миеломы. 6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лейкемии представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии или В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии. 7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лимфомы представляют собой В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 8. Способ индуцирования апоптоза В-клеток неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из 1-9. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 10. Способ экспрессии -40 на В-клетках неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из 1-9. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 15979 1 2012.06.30 12. Способ индуцирования продукции -10 В-клетками неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из 1-9. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и предусматривает девять олигонуклеотидов с последовательностями, которые показаны в 1 до 9 для ингибирования В-клеточной неоплазмы млекопитающего. Основываясь на системе классификации 1 лимфоидная злокачественность группируется на три главных класса В-клеточную неоплазму, Т-клеточную неоплазму(естественные киллеры)и лимфому Ходжинкса. В дальнейшем В-клеточная неоплазма делится на две группы предшественники В-клеточной неоплазмы и периферическая В-клеточная неоплазма. Предшественники В-клеточной неоплазмы включают в себя предшественники В-клеточной острой лимфобластной лейкемии (В-клеточная острая лимфобластная лейкемия, -)/ лимфобластная лимфома . Периферическая В-клетка неоплазмы включают в себя В-клетку хронической лимфоцитарной лейкемии(В-), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, лимфоплазматическую лимфому/иммуноцитому, -клеточную лимфому,фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую В-клеточную маргинальную зону лимфомы типа , узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны (/- моноцитоид В-клеток), лимфому селезеночную маргинальной зоны(/-ворсинчатые лимфоциты), волосатоклеточную лейкемию, плазмоцитому/плазмаклетку миеломы, диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную В-клеточную лимфому, интраваскулярную крупноклеточную В-лимфому, первичную лимфому и лимфому Беркитта. В-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия (-) и В-клеточная острая лимфобластическая/лимфоцитарная лейкемия (-) являются двумя типами В-клеточной лейкемии.- клетки экспрессируют 19, 5 и 23. - клетки экспрессируют 1910 маркеры. Мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома является В-клеточной неоплазмой. Моноклональная популяция В-клеток в мелкоклеточной лимфоцитарной лимфоме экспрессирует 19, 5 и 23. 40, экспрессируемая на клеточной поверхности нормальных В-лимфоцитов и дентрических клеток, принадлежит к группе рецепторов фактора некроза опухолей . 40 (154), экспрессируемая на Т-лимфоцитах, принадлежит к группе рецепторов фактора некроза опухолей. Взаимодействие 40 и 40 способствует пролиферации,дифференцировке и антигенной презентации В-лимфоцитов, дендрических клеток и моноцитов. 40 также экспрессируется на неопластических В-клетках. Увеличение экспрессии 40 вызывает апоптоз неопластических В-клеток. В экспериментах как, так ибыло показано, что стимуляция и увеличение 40 вызывает замедление роста неопластических В-клеток 2, 3. Известно, что стимулирование экспрессии 40 на неопластических В-клетках усиливает антигенные свойства неопластических В-клеток и, следовательно, стимулирует производство специфических к этим клеткам Т-лимфоцитов .могут эффективно убивать неопластические В-клетки 4. В присутствии экспессирующих 40, 40 В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии могут быть убиты 4 цитотоксическими Т-лимфоцитами. Взаимодействие между 40 и 40 на клетках лимфомы Буркетта 2 15979 1 2012.06.30 может провоцировать клетку на презентирование опухолевых атигентов специфическим. В экспериментахи клинических исследованиях также было продемонстрировано, что активация 40 может улучшать иммуногенность клеток В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (-) и, следовательно, вызывать размножение ,специфических для этих клеток 5. В то же время эти данные показывают, что увеличение экспрессии 40 на неопластических В-клетках может стимулировать антиопухолевый иммунитет по отношению к В-клеточной неоплазме. Антиопухолевый иммунитет включает, но не ограничивается следующим 1. Стимулирование апоптоза неопластических В-клеток. 2. Подавление роста неопластических В-клеток. 3. Улучшение иммуногенности неопластических В-клеток и, следовательно, стимулирование размножения , специфических для этих клеток. Интерлекин-10 (-10) является гомодимером цитокина, продуцированного некоторыми Т-клетками, моноцитами, макрофагами и некоторыми неопластическими клетками,происходящими из В-клеток, Т-клеток или -клеток 6. Активность -10 опосредуется специфическим поверхностным клеточным рецептором, экспрессируемым на антигенпрезентирующих клетках, лимфоцитах, а также В-клетках хронической лимфоцитарной лейкемии (-). Было обнаружено, что добавление экзогенной -10 ингибирует разрастание - клеток, свежевыделенных от больных 7. Сообщается также о том, что -10 ингибирует разрастание В- клеток и усиливает апоптоз В- клеток 8. Иммуностимулирующие антираковые свойства -10 дают предположение о том, что избыточная экспрессия -10 в опухолевом микроокружении может катализировать раковое иммунное отторжение. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в создании способа ингибирования В-клеток неоплазмы млекопитающего, индуцирование апоптоза В-клеток неоплазмы, увеличение экспрессии -10 в опухолевом микроокружении и стимулирование продукции -10 В-клетками неоплазмы. Поставленная задача решается предлагаемым способом ингибирования В-клеточной неоплазмы путем контактирования В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидами, имеющими последовательность, продемонстрированную в 1-9 соответственно, и их функциональными гомологами, используя олигонуклеотиды, которые вызывают апоптоз В-клетки в неопластических клетках, улучшают экспрессию 40 на В-клетках неоплазмы и индуцирует В-клетки неоплазмы для воспроизведения -10. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут использоваться индивидуально либо в совместно, либо быть использованы в комбинации с химиотерапией, иммунотерапией и облучением для лечения В-клеточной неоплазмы. Способ поясняется следующими примерами и иллюстрациями, представленными на фиг. 1-3, где в первом примере представлен способ, который осуществляют путем контактирования В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из девяти олигонуклеотидов, таких как 1,3,4,5,6,7, 8,9,10 с последовательностью, продемонстрированной в 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 соответственно, и их функциональными гомологами. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь модификацию фосфатной цепи, которая проявляется в частичной или полной модификации фосфоротиата или фосфородитиата. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь химические модификации или иметь замещения с превосходящими основаниями. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут быть функциональной частью любого другого олигонуклеотида или фрагмента ДНК или быть клонированы в плазмид,бактериальный вектор, вирусный вектор или вакцину ДНК соответственно. Олигонуклео 3 15979 1 2012.06.30 тиды с последовательностью 1-9 могут быть модифицированы путем добавления одного или двух оснований (предпочтительнее от 1 до 10 оснований) к концу каждого олигонуклеотида или заменой одного или более оснований в них. Специалисты могут определить использование олигонуклеотидов с последовательностью 1-9 или их функциональных гомологов индивидуально или совместно, или использовать фрагменты ДНК, включающие в себя олигонуклеотиды с последовательностью (1-9) соответственно для достижения цели изобретения, основанной на хорошо известных фактах и рассматриваемых в данном изобретении. В-клеточная неоплазма включает, но не ограничивается В-клеточной лейкемией,В-клеточной лимфомой или миеломой. Во втором примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеточной неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно в объекте исследования. Объектом является человек или животное. В-клеточная неоплазма включает, но не ограничивается Вклеточной лейкемией, В-клеточной лимфомой или миеломой. В третьем примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно путем индуцирования апоптоза неопластических В-клеток. В четвертом примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно путем увеличения экспрессии 40 на неопластических В-клетках. В пятом примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования роста В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно путем стимулирования продукции -10 неопластическими В-клетками. В остальных примерах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеток неоплазмы, заключающийся в контактировании В-клеток неоплазмы с эффективным количеством олигонуклеотидов или их функциональных гомологов по данному изобретению. Краткое описание чертежей. Фиг. 1. Эффект уменьшения 40 на неопластических - клетках.- клетки были инкубированы с или без олигонуклеотидов в течение 7 дней и затем были окрашены с помощью -40 антител для анализа экспрессии 40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии был указан с помощью показателей . Фиг. 2. Влияние олигонуклеотидов на содержание 40 на мелкоклеточной лимфоидной лимфоме. Клетки мелкоклеточной лимфоидной лимфомы были инкубированы с или без олигонуклеотидов. На 7-й день клетки были окрашены с помощью -40 антител для анализа экспрессии 40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии указывался с помощью показателей . Фиг. 3. Влияние олигонуклеотидов на пролиферацию обычной человеческой . Обычные человеческиекультивировались с или без олигонуклеотидов и затем клеточная пролиферация была оценена по инкорпорации 3 меченого тимидина. Разрастание клеток было выражено как . Подробное описание изобретения. Определения. В данном изобретении используются термины со следующими определениями 15979 1 2012.06.30 Олигонуклеотид представляет собой множество нуклеотидов (например, молекулы,содержащие сахар (например, дезоксирибоза), связанные с фосфатной группой и взаимозаменяемым органическим основанием). Существует четыре органических основания цитозин , тимин , аденини гуанин . Олигонуклеотид можно синтезировать с помощью автоматического синтезированного олигонуклеотида, который может быть доступен на рынке или может быть приготовлен из имеющихся последовательностей нуклеиновых кислот используя известный метод. Аолигонуклеотида означает, что олигонуклеотидом может быть фосфороциатно модифицированное фосфатное основание (где, например, по крайней мере один из кислородов фосфата замещается серой) или другое модифицированное основание. Химическая модификация олигонуклеотида означает модификацию путем использования активных групп нуклеотида или создание аналогов нуклеотида. Модификации могут иметь место или в течение или после синтеза олигонуклеотида. Во время синтеза модифицированные основания (включающие, но не ограничивающиеся аналогами тимидина) могут быть встроены внутрь или к 5 окончанию. После синтеза модификация может быть проведена с использованием активных групп (посредством амино-модификатора или 3 или 5 гидроксильной группы или через фосфатную группу). В-клеточная неоплазма означает заболевания, развивающиеся вследствие патологической пролиферации клеток В-лимфоцитарного ряда. В-клеточная неоплазма может быть подразделена на В-клеточную лейкемию, В-клеточную лимфому и миелому (плазмоцитома/плазмоклеточная миелома). В-клеточная лейкемия включает В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (-), острую лимфобластную лейкемию (В-предшественник), В-клеточная острая лимфоцитарная лейкемия (-), В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию и волосатоклеточную лейкемию. В-клеточная лимфома включает мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфоплазмацитарную лимфому/ иммуноцитому, -клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны типа ,узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны (/- моноцитоидных В-клеток), лимфому селезеночной маргинальной зоны (/- ворсинчатые лимфоциты), диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-лимфому,внутрисосудистую крупноклеточную В-лимфому, первичновыпотную лимфому и лимфомы Беркетта. Объект означает млекопитающее, включающее, но не ограничивающееся человеком,обезьяной, собакой, кошкой, лошадью, коровой, свиньей, козлом, овцой, мышью и крысой. Олигонуклеотиды по представленному изобретению могут быть введены объекту с В-клеточной неоплазмой. Фактор анти-В-клеточной неоплазмы означает фактор, используемый при леченияи В-клеточной неоплазмы в объекте. Фактор включает олигонуклеотиды данного изобретения, химиотерапевтические, иммунотерапевтические средства и средства, используемые в радиотерапии. Олигонуклеотиды данного изобретения могут назначаться до, во время или после введения одного или более антинеопластических агентов для достижения синергичного эффекта при лечении В-клеточной неоплазмы. Олигонуклеотиды по данному изобретению в комбинации с другим агентом могут быть отдельными композициями и использоваться в качестве следующего (1) олигонуклеотиды, которые смешаны со вторым агентом перед введением (2) олигонуклеотиды и второй агент вводятся объекту в разное время (3) олигонуклеотиды и второй агент вводятся в различные части объекта. Кроме того, композиция может содержать плазмиду,бактериальные векторы, вирусные векторы и вакцину нуклеиновой кислоты для осуществления последовательности олигонуклеотидов по данному изобретению. 5 15979 1 2012.06.30 Примеры. Нижеприведенные примеры являются пояснительными и не должны ограничивать объем данного изобретения. Целесообразные вариации, которые относятся к целесообразным мелким производителям, могут быть сделаны без отклонения от объема изобретения. Пример 1. Синтез олигонуклеотида. В способе используют разработанные и синтезированные олигонуклеотиды со следующими последовательностями и номенклатурами 15 (обозначенные в 1), 353 (обозначенные в 2), 453 (обозначенные в 3), 553 (обозначенные в 4), 65--3 (обозначенные в 5), 753 (обозначенные в 6), 853 (обозначенные в 7), 953 (обозначенные в 8), 101 (обозначенные в 9). Для анализа функций всех вышеобозначенныхбыли синтезированы два контрольных олигонуклеотида 2006 с последовательностью 53 и 2216 с последовательностью 53. Каждый из олигонуклеотидов был синтезирован в(, ), проверен на эндотоксичность с помощью лизата(, ) и превращен в апирогенные реагенты. 2006 (20001641617) является хорошо изученным олигонуклеотидом, который интенсивно активизирует нормальные В-клетки. 2216 (2001 312154) является еще одним хорошо изученным олигонуклеотидом, который индуцирует высокий уровень количества интерферона типав дентрических плазмацитоидных клетках. Методы синтезирования олигонуклеотида хорошо известны специалистам, и наряду с другими обычно используется твердофазный синтез . В качестве твердого носителя используется пористое стекло с определенным размером гранул. Эти гранулы имеют поверхность с отверстиями и каналами, и это дает возможность прикрепиться защищенному нуклеотиду. Синтез олигонуклеотида начинается с 3- нуклеотида и протекает через серию циклов, составляет 5 шагов, которые повторяются до тех пор, пока не прикрепится 5 нуклеотид. Этими шагами являются депротекция, активация, сцепление, закрытие и стабилизация. Шаг 1. Депротекция. Защитная группа в охраняемом нуклеозиде, прикрепленном к грануле, удаляется при помощи трихлоруксусной кислоты, оставляя реактивную 5-гидроксильную группу. Шаг 2. Активация. На данном шаге тетразол действует на фосфорамидит нуклеозид сцепление, формируя промежуточную форму - тетразолил фосфорамидит. Шаг 3. Сцепление. Промежуточная форма тетразолил фосфорамидита взаимодействует с гидроксильной группой реципиента и формируется связь между 5 и 3. В результате восстанавливается тетразол и процесс продолжается. Шаг 4. Закрытие. На данном шаге ацетилирующий реагент, состоящий из уксусного ангидрида и-метил имидазола, используется для блокирования реактивной гидроксильной группы на 5- конце олигонуклеотида для предупреждения последующей ошибки сцепления. 6 15979 1 2012.06.30 Шаг 5. Стабилизация. Как только завершается этап (шаг) закрытия, последним шагом в цикле является оксидация, которая стабилизирует фосфатную связь между растущей цепью олигонуклеотида и последним добавленным основанием. Данный шаг проводится в присутствии йода как слабого оксиданта в тетрагидрофуранеи воде. Если придерживаться данного последнего шага, то идет повторение цикла для каждого нуклеотида в последовательности. По окончании синтеза одиночно скрученная молекула ДНК очищается с помощью таких методов, как , , , 18 и . Пример 2. Апоптоз человеческих - клеток, индуцированных олигонуклеотидами. 1. Подготовка человеческих - клеток. Были отобраны образцы крови у не леченных - (патологически идентифицированных) больных (,, ) после получения письменного подтверждения согласия. Периферические мононуклеарные клетки кровибыли изолированы путем центрифугирования в градиенте плотности - . Клетки 51923- в периферических мононуклеарных клетках крови были очищены с помощью В-клеточного изолирующего набора ( , , ) с содержанием 51923(- ) более 95 . Клеточный препарат был сделан по руководству. Пример 3. Апоптоз человеческих - клеток, индуцированных олигонуклеотидами. Клетки - инкубировались с 1,3,4,5,6,7, 8,9,10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 (способ)в 106 клеток на лунку в 48 луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в сывороточной среде 1640. Такой же объем был использован в качестве контрольного. На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира,.. - . 279. - . 23. -4. - . 24152-24162. - 2004 в течение 10 минут. -положительные (жизнеспособные) и -отрицательные (апоптические) - клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Количество жизнеспособных - клеток было определено путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на десяти образцах крови от - больных и общий результат показал (10), что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз клеток (табл. 1). Таблица 1 Апоптоз - клеток, индуцированных олигонуклеотидами-, (10) 82,2 79,5 81,3 2006 66,5 44,4 40,2 2216 67,7 57,7 50,7 Табличные надписи Жизнеспособные - клетки лимфоцитарной лимфомы ,10 Группы Время инкубации (дни) Среда Пример 4. Увеличение экспрессии 40 на человеческих - клетках с помощью олигонуклеотидов. 1. Приготовление человеческих - клеток. Человеческие - клетки были изъяты у - больных с помощью процедуры, описанной в примере 2. 2. Увеличение экспрессии 40 на человеческие - клетки с помощью олигонуклеотидов.- клетки инкубировались с 1,3,4,5,6,7, 8,9,10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разведены бессывороточной средой 1640. Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контрольный . На седьмой день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью антител -40 ( ) ,.. - . 279. - . 23. -4. . 24152-24162. - 2004 в течение 10 минут. - клетки, окрашенные антителами к 40, были обнаружены с помощью проточной цитометрии (. .). Результат(фиг. 1) показывает, что олигонуклеотиды значительно увеличивает экспрессию 40 на- клетки, свидетельствуя о том, что олигонуклеотиды могут использоваться для лечения - путем экспрессии 40 на клетки. Экспрессия 40 вызывает апоптоз- клеток, приводит к ингибированию роста - клеток и приводит - клетки в более иммуногенное состояние для стимуляции размножения , специфических для- клеток. Эксперимент был повторен как минимум на десяти образцах крови от- больных с похожими результатами. Пример 5. Стимулирование продуцирования -10 из -, индуцированных олигонуклеотидами. 1. Подготовка человеческих - клеток. Человеческие - клетки были изъяты у - больных с помощью процедур,описанных в примере 2. 2. Продукция -10 клетками -, индуцированными олигонуклеотидами.- клетки были культивированы с 1,3,4,5,6,7,8,9,10 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке в трех экземплярах. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . Супернатант культуры был собран через 24 часа или в заданное время и оценен на предмет -10 в системе( ). Наши данные показали, что олигонуклеотиды инициируют продукцию до 8 15979 1 2012.06.30 высокого уровня -10 - клетками (табл. 5). Кроме того, наши данные впоследствии показали, что добавление экзогенного 10 ( ) в культуру - клеток индуцировало апоптоз - клеток дозазависимым от -10 способом, который мог быть специфически блокирован антителами -10 . Эксперимент был повторен с использованием по крайней мере десяти образцов изъятых у - больных. С аналогичными результатами. Таблица 5 Продукция интерлейкина-10 клетками -, индуцированными олигонуклеотидами 01,2 Табличные надписи Продукция интерлейкина-10 (-10) клетками Группа Среда Пример 6. Апоптоз клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванных олигонуклеотидами. 1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были выделены путем биопсии лимфотического узла от больных (,, ) с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой (патологически идентифицированной) после получения информированного письменного согласия. Биоптат был измельчен с помощью шероховатой поверхности предметного стекла для выделения клеток в 510 человеческойсывороточной среде 1640 в 6-сантиметровую плашку для культивирования. Отделенные клетки были профильтрованы через ячейки нержавеющей стали и собраны в 50 коническую пробирку, содержащую 15 мл бессывороточной среды 1640 . Пробирка была центрифугирована при 300 в течение 10 минут и затем надосадочная жидкость была слита. 51923 клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были очищены с использованием изоляционного комплекта (,, ) до содержания 51923 более 95 . Клеточный препарат был сделан по руководству. 2. Апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванный олигонуклеотидами. Клеткимелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы инкубировались с помощью 1, 3,4,5,6,7,8,9,10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 9 15979 1 2012.06.30 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира,.- клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Число жизнеспособных - клеток было рассчитано путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на пяти образцах, изъятых у больных с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой, и общий результат (5) показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы(табл. 2), что свидетельствует о том, что олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем индуцирования апоптоза клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Таблица 2 Апоптоз мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, индуцированной олигонуклеотидами, (5) 81,2 78,4 77,1 2006 67,6 45,3 41,1 2216 68,5 58,7 52,1 Табличные надписи Жизнеспособные мелкие клетки лимфоцитарной лимфомы ,10 Группы Время инкубации (дни) Среда Пример 7. Влияние олигонуклеотидов на экспрессию 40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. 1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были изъяты у больных с помощью методов, описанных выше. 2. Влияние олигонуклеотидов на экспрессию 40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были инкубированы с 1, 3,4,5,6,7,8,9,10, 2006 или в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На седьмой день инку 10 15979 1 2012.06.30 бации клетки были посчитаны и окрашены с антителом -40 ( ) ,.. - . 279. . 23. -4. - . 24152-24162. - 2004 в течение 10 минут. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, окрашенные антителом 40, были детерминированы с использованием проточной цитометрии (. ),). Результат (фиг. 2) показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию 40 на клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, показывая, что олигонуклеотиды могут использоваться для лечения мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем регуляции воздействия 40 на клетки. Увеличение количествастимулирует апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, индуцирует ингибирование клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы и приводит клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы в более иммуногенное состояние для стимулирования генераций, специфических для этих клеток . Эксперимент был повторен на 5 образцах с похожими результатами. Пример 8. Апоптоз клеток человеческой острой - острой лимфоцитарной лейкемии, индуцированных олигонуклеотидами. 1. Подготовка человеческих - клеток. Были изъяты образцы крови от необработанных - (патологически идентифицированных) больных (,, ) после получения информированного письменного согласия.были изолированы с помощью -центрифугирования в градиенте плотности. 1910- клетки вбыли очищены с использованием В-клеточного изолирующего набора ( ,, ) до содержания 1910 клеток (- клетки) более 95 . Подготовка клетки осуществлялась в соответствии с руководством. 2. Апоптоз - клеток, индуцированных олигонуклеотидами.- клетки были инкубироавны с 1,3,4,5,6,7, 8,9,10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде 1640 . Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира,.. - . 279. - . 23. -4. - . 24152-24162. - 2004 в течение 10 минут. -положительные (жизнеспособные) и -негативные (апоптические) - клетки были определены с помощью проточной цитометрии (. .). Число жизнеспособных - клеток было рассчитано путем умножения общего количества клеток на процент -положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент, проведенный на десяти образцах крови, изъятых у больных, с получением подобных результатов (10), показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз - клеток (табл. 3) и доказывает, что олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения - путем индуцирования апоптоза - клеток. Таблица 3 Апопотоз - клеток, индуцированных олигонуклеотидами-, (10)-, (10)3 5 70,6 68,2 66,4 61 75,9 70,1 80,1 74,9 67,2 63,1 72,6 68,1 91,5 92,7 94,9 95 62,9 58,4 Жизнеспособные - клетки ,10 Группы Время инкубации (дни) Среда Пример 8. Увеличение экспрессии 40 на - клетки олигонуклеотидами. 1. Подготовка человеческих - клеток. Человеческие - клетки были подготовлены из образцов крови больных с помощью процедур, описанных в примере 6.- клетки были инкубированы с 1,3,4,5,6,7, 8,9,10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 / в 10 человеческойсывороточной среде 1640 в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке.2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде 1640. Такой же объем разбавителя (1640( был использован как контроль . На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью -40 антител ( ),.. - . 279. - . 23. -4. . 24152-24162. - 2004 в течение 10 минут. Клетки мелкоклеточной лимфоидной лимфомы, окрашенные с помощью антител 40, были детерминированы с помощью проточной цитометрии (. .). Эксперимент, проведенный на десяти образцах крови,изъятых у больных, с получением таких же результатов (табл. 4), показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию 40 на - клетки, показывая, что олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения - путем увеличения количества 40 на клетки. Экспрессия 40 способствует апоптозу - клеток, индуцируя ингибирование - клеток, и приводит - клетки в более иммунногенное состояние для стимулирования генерации , специфических для - клеток. Таблица 4 Экспрессия 40 на - клетках олигонуклеотидами 40-, (10) 7,2 7,9 8,5 2216 9,9 9,5 10,6 2006 33,7 33,8 34,1 Табличные надписи Экспрессия 40 на В-клеточную острую лимфоцитарную лейкемию ,10 Группы Время инкубации (дни) Среда Пример 9. Эффект олигонуклеотидов на пролиферацию человеческой нормальной . Человеческиебыли изолированы от лейкоцитарного слоя нормальной донорской крови (, ) с помощью центрифугирования градиента плотности - . Жизнеспособностьсоставляла 9599 по методу вытеснения трипаново синего.(6105/) были размещены в 96-луночной плошке с -образным дном и культивированы с или без 1,3,4,5,6,7, 8,9,10, 2006 или 2216 относительно конечной концентрации 6 / в трех экземплярах в течение 36 ч с последующей обработкой 3 тимидином (, , ) в течение 16 ч. Клетки были собраны на стекловолоконных фильтрах и измерены сцинтилляционным счетчиком. Пролиферация клеток была выражена через( ) (из трех лунок). Были представлены данные от 5 нормальных образцов крови. 2006 и 2216 были использованы как контроль. Результаты показали, что олигонуклеотиды могут отчетливо стимулировать пролиферацию(фиг. 3), показывая, что олигонуклеотиды, вместо индуцирования апоптоза, стимулируют пролиферацию нормальных человеческихи нетоксичны для культивированных клеток. На основании детального описания изобретения и в соответствии с его реализацией(воплощением) специалисту в соответствующей области будет очевидно, что модификации и вариации возможны без выхода за рамки данного изобретения, как это определено в нижеследующих прилагаемых пунктах формулы изобретения. Источники информации 1. Система классификации//. - 1997. . 21 (1). - . 114-121. 2..,83, 1994. -. 2787-2794.,86, 1995. . 1946-1953 , . .,., 1996. 3.132243 , ., . 1999.932999 , . .,., 2001. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 14