Способ получения разделяющих твердофазных реагентов для иммуноанализа

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАЗДЕЛЯЮЩИХ ТВЕРДОФАЗНЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОАНАЛИЗА(73) Патентообладатели Свиридов Олег Васильевич, Стрельченок Олег Анатольевич,Чащин Вадим Леонидович(57) 1. Способ получения разделяющих твердофазных реагентов для иммуноанализа, включающий иммобилизацию на твердом носителе специфического биотинсвязывающего белка напрямую или через специфическую связь с конъюгатом производного биотина и инертного белка, отличающийся тем, что носитель предварительно подвергают обработке гамма-излучением, целевой продукт стабилизируют путем обработки раствором инертного пленкообразующего материала и высушиванием. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют пластмассовые изделия, в частности, из полиэтилена, полипропилена, полистирола или композиционных материалов на их основе. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку гамма-излучением ведут до поглощенной дозы 25100 кГр, предпочтительно от источника 60 Со. 4. Способ по п.п. 1 или 3, отличающийся тем, что поверхность носителя после воздействия гаммаизлучения дополнительно подвергают обработке инертным органическим растворителем. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве инертного органического растворителя используют органический растворитель, не разрушающий поверхность пластмассового изделия и не вызывающий ее видимых повреждений. 4248 1 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пленкообразующий материал выбирают из группы, включающей сахарозу, лактозу, поливинилпирролидон. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт дополнительно стабилизируют сшивающим бифункциональным реагентом. 8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что сшивающий бифункциональный реагент представляет собой глутаровый альдегид. Изобретение относится к области медицинского иммуноанализа, а именно к технологиям лабораторного изготовления и промышленного производства отдельных реагентов и комплектных наборов реактивов для иммуноанализа. Важнейшими компонентами современных наборов для иммуноанализа являются разделяющие твердофазные реагенты, которые включают иммобилизованные на нерастворимом носителе белки для специфического связывания в иммуноаналитической системе комплекса антитело-антиген и отделения этого комплекса от свободных антитела и антигена. Наиболее удобными носителями являются формованные пластмассовые изделия, например пробирки или микропланшеты с лунками, а также помещаемые в пробирки миниатюрные изделия с большой площадью поверхности, такие, как шарики, турбинки и т.п. Наиболее распространенными материалами для таких изделий являются полистирол, полиэтилен и полипропилен. Специфические белки закрепляют на рабочей поверхности носителя чаще всего следующими тремя способами 1) прямая физическая (пассивная) адсорбция, 2) ковалентное присоединение за счет активированных функциональных групп, привитых к поверхности пластика, 3) опосредованная (активная) адсорбция с участием сил биоспецифического сродства, например,через высокоаффинные авидин-биотиновые системы (константа сродства порядка 1015 М-1)1-3. Главными требованиями к технологии нанесения специфического связывающего белка на пластмассовые изделия являются следующие 1) максимально полное и равномерное покрытие рабочей поверхности предпочтительно монослоем активных молекул для обеспечения большой и инвариабельной связывающей емкости, 2) высокая устойчивость покрытия в условиях иммуноанализа и при хранении твердофазного реагента,так как утечка белка вследствие разрушения связей с носителем приводит к ошибкам в анализе и порче реагента 1. В качестве прототипа заявляемого изобретения выбран способ нанесения специфического биотинсвязывающего белка (авидин, стрептавидин или их производные) на пластмассовый носитель напрямую (вариант 1) или опосредованно через адсорбированную на пластике систему инертный белок-биотин (вариант 2) 4. Вариант 1 способа-прототипа заключается в следующем. Авидин растворяют в буфере с рН 9,6, в этот раствор(500 мкг/мл) помещают полистирольные шарики, выдерживают при комнатной температуре в течение 20 ч,жидкую фазу удаляют, промывают твердую фазу несколько раз физиологическим буфером, выдерживают 20 ч при комнатной температуре в растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) и получают целевой продукт с прямой иммобилизацией специфического биотинсвязывающего белка. В варианте 2 способа-прототипа на рабочую поверхность пластмассового изделия (лунки микропланшета) наносят первый слой покрытия из инертного белка (БСА), ковалентно конъюгированного с биотином. Конъюгат биотин-БСА растворен в 0,05 М натрий-карбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 10 мкг/мл. Физическую адсорбцию конъюгата проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки наносят второй слой покрытия, состоящий из авидина. Нековалентное биоспецифическое взаимодействие между биотином из первого слоя и авидином протекает при концентрации авидина 50 мкг/мл в 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 7,0) и температуре 37 С в течение 1 ч. В результате получают целевой продукт с опосредованной иммобилизацией специфического биотинсвязывающего белка. Недостатки способа-прототипа проявляются в свойствах целевых продуктов 1) недостаточная емкость и повышенная вариабельность связывания комплекса антитело-антиген целевыми продуктами из-за малой и неравномерной адсорбируемости биотинсвязывающего белка по существующему способу, 3) неустойчивость целевых продуктов в условиях транспортирования, хранения и применения медицинским потребителем. 4248 1 Задачей настоящего изобретения является способ получения разделяющих твердофазных реагентов для иммуноанализа, которые 1) характеризуются высокоэффективной разделяющей способностью за счет большой емкости и низкой вариабельностью связывания комплекса антитело-антиген, 2) обладают долговременной устойчивостью при выдерживании в естественных условиях и при жестких воздействиях. В соответствии с изобретением описывается способ получения разделяющих твердых фаз для иммуноанализа, который заключается в следующем. Твердый носитель, в качестве которого используют формованное пластмассовое изделие из полистирола,полиэтилена, полипропилена или композиционных материалов на их основе, подвергают обработке гаммаизлучением, предпочтительно от источника 60 Со до поглощенной дозы 25-100 кГр. Для закрепления полезных изменений в поверхности, вызванных радиацией, носитель дополнительно обрабатывают инертным органическим растворителем. Причем в качестве инертного органического растворителя используют органический растворитель, не разрушающий пластмассовое изделие и не вызывающий видимых повреждений его поверхности. На обработанный твердый носитель за счет сил физической адсорбции белка наносят первый слой покрытия из специфического биотинсвязывающего белка (стрептавидин, авидин или их производные) или конъюгата биотин-инертный белок. При использовании биотинсвязывающего белка образуется конечный продукт, который после стабилизации по заявляемому способу используется как разделяющий твердофазный реагент в имммуноанализе. В случае применения конъюгата биотин-инертный белок получают полупродукт, который превращают в целевой продукт путем добавления раствора специфического биотинсвязывающего белка. При этом биотинсвязывающий белок закрепляется на первом слое за счет сил биоспецифического сродства между одним из своих четырех активных центров и биотином. В результате образуется конечный продукт, который после стабилизации применяется как разделяющий твердофазный реагент в иммуноанализе. После нанесения каждого слоя биопокрытия избыток реактивов в жидкой фазе удаляется промывкой. Целевые продукты стабилизируют путем нанесения защитной пленки из растворимых в воде материалов и высушивания. Пленкообразующий материал выбирают из группы, включающей сахарозу, лактозу, поливинилпирролидон. Возможна дополнительная химическая стабилизация целевого продукта путем обработки раствором сшивающего бифункционального реагента. При этом сшивающий бифункциональный реагент представляет собой, в частности, глутаровый альдегид. Заявляемый способ имеет следующие существенные отличительные признаки 1) обработка пластмассового изделия гамма-лучами и, при необходимости, органическим растворителем перед биопокрытием, 2) стабилизация целевых продуктов физической обработкой и дополнительно химической обработкой. Каждый из названных отличительных признаков дает следующие положительные эффекты, которые нельзя было предвидеть при постановке цели изобретения. 1. Обработка гамма-лучами и дополнительно органическим растворителем существенно повышает эффективность разделяющего действия целевых продуктов заявляемого способа в иммуноанализе, что проявляется в увеличении емкости и снижении вариабельности связывания комплекса антитело-антиген. Это достигается за счет повышения качества покрытия твердого носителя биотинсвязывающим белком. По-видимому, радиационная обработка приводит к появлению дополнительных центров пассивной адсорбции и их равномерного распределения по поверхности пластмассового изделия. Известно применение гамма-облучения при радиационной прививочной сополимеризации с целью получения полимера, содержащего привитые функциональные группы, для химического присоединения макромолекул 2. Известно также использование гамма-радиации от источника 60 Со при поглощенной дозе 10-100 кГр для включения низкомолекулярных соединений в формованные изделия из полистирола с целью прививки к поверхности полимера функциональных групп для химического присоединения иммуноглобулинов 5. В литературе также указывается, что гамма-облучение дозами около 100 кГр таких неорганических сорбентов,как силикагель или окись алюминия, увеличивает емкость физической адсорбции по отношению к малым молекулам за счет образования в поверхностном слое дополнительных дефектов, которые могут выступать в качестве новых центров адсорбции 2. Однако, по литературным данным, существующие методы контроля не выявляют даже ничтожных радиационных повреждений полистирола или полиэтилена, обычных материалов, из которых формуются пластмассовые изделия для иммуноанализа, при поглощенной дозе 100 кГр. Изменение физических свойств, которое проявляется, в частности, как разрушение кристаллитов (уменьшение степени кристалличности) полиэтилена, полипропилена и других пластмасс, имеющимися методами детектируют при очень большой поглощенной дозе (около 35 МГр 2). Следовательно, биологическое покрытие по заявляемому способу является не только средством достижения цели изобретения, но и может служить высокочувствительным тестом на поверхностные изменения в пластике под действием радиации. Изменения физических свойств поверхности пластмассы, вызванные гамма-радиацией и имеющие характер обратимых явлений 2, скорее всего закрепляются во времени при выдерживании изделия в органическом растворителе. Кроме того, органический растворитель может способствовать образованию и равномерному распределению дополнительных центров адсорбции уже химического происхождения. 4248 1 2. Стабилизация путем обработки, например, растворами сахарозы, лактозы или поливинилпирролидона и высушивания обеспечивает сохранение активных центров иммобилизованного биотинсвязывающего белка за счет образования защитной пленки на рабочей поверхности твердофазного реагента. Дополнительная химическая стабилизация путем обработки бифункциональным реагентом, например глутаровым альдегидом, ковалентно сшивает по аминогруппам белки из различных слоев покрытия и таким образом прочно закрепляет биоспецифически ориентированные белковые слои на носителе. В результате целевой продукт заявляемого способа приобретает повышенную по сравнению с прототипом устойчивость в экстремальных условиях, которые могут возникнуть в процессе его изготовления, транспортирования, хранения и применения. В примерах, поясняющих изобретение, но не ограничивающих его, проводится прямое экспериментальное сравнение способа-прототипа и заявляемого способа по следующим параметрам качества разделяющих твердых фаз для иммуноанализа 1) масса биотинсвязывающего белка (стрептавидина), адсорбированного напрямую или через конъюгат инертный белок-биотин на рабочей поверхности пластмассового изделия, 2) максимальная связывающая емкость, 3) коэффициент вариации связывания комплекса антиген-антитело, 4) степень уменьшения связывающей активности при выдерживании в естественных условиях ускоренного старения (72 ч при 37 С) и в агрессивных условиях экстремальных воздействий (обработка покрытых пробирок 0,05 М буфером глицин- (рН 2,6), содержащим 6 М гуанидинхлорид и 30 ацетонитрила). В качестве носителей биопокрытия используются следующие пластмассовые изделия 1) пробирки из полистирола, стандартные с внутренним диаметром 10 мм и длиной 75 мм, по ТУ РБ 147 500615.001-95,серийная продукция научно-производственного кооператива Бион, Минск, далее по тексту - пробирки Бион, 2) пробирки из полистирола 12 х 75 мм, серийная продукция фирмы ЕКау , ., США, номер по каталогу 000-2052-, партия 9142, далее по тексту - пробирки ЕКау, 3) микропланшеты (9 х 13 см) из полистирола с 96 лунками (сборные из 12 полосок по 8 лунок), серийная продукция фирмы,Финляндия, номер по каталогу 781041 (прозрачные, для колориметрии), далее по тексту - микропланшеты, 4) микропланшеты того же формата, полистирольные, серийная продукция фирмыОу,Финляндия, номер по каталогу 9502887 (матовые, для люминометрии), далее по тексту - микропланшеты, 5) турбинки миниатюрные (масса 1 шт. - 0,1 г) из композита полиэтилена и полипропилена для внесения в пробирки, система , серийная продукция фирмы, Франция, далее по тексту - турбинки . Материалы для биопокрытия приготавливают следующим образом. Не содержащие протеазной активности инертные белки, которые являются массовыми продуктами биоиндустрии - например, БСА, общий иммуноглобулин сыворотки быка, яичный альбумин- биотинилируют -оксисукцинимидным эфиром биотина , а конъюгаты очищенных антител или антигенов с биотином получают с использованием-оксисукцинимидного эфира аминокапроильного производного биотина . Стрептавидин выделяют из культуральной жидкости штаммаВКМ Ас 1047 осаждением сульфатом аммония (насыщение 70 ) и используют без дальнейшей очистки, контролируя концентрацию стрептавидина в растворах биоспецифическим методом, или же очищают аффинной хроматографией на иминобиотин-агарозе и количественно определяют белок по коэффициенту экстинкции 7. Антивидовые антитела получают в чистом виде с помощью антиген-аффинной хроматографии антисыворотки животного одного вида на сорбенте,содержащем в качестве иммобилизованного антигена иммуноглобулин животного другого вида. Антитела к целевому (определяемому в иммуноанализе) антигену частично очищают из асцитической жидкости или поликлональной антисыворотки последовательным осаждением каприловой кислотой и сульфатом аммония или же выделяют в чистом виде аффинной хроматографией. Антигены, применяющиеся в иммуноанализе аутоантител, экстрагируют из ткани щитовидной железы человека и далее очищают традиционными методами белковой химии, описанными для тиреопероксидазы (ТПО) 8 и тиреоглобулина (Тг) 9. Целевые продукты заявляемого и известного способов испытывают в иммуноаналитических системах различных типов радиоиммунной, иммунорадиометрической, иммуноферментной и иммунолюминометрической. Качественные и количественные характеристики заявляемого способа и способа-прототипа определяют также в радиометрических экспериментах с раздельным применением меченых йодом-125 препаратов конъюгатов биотин - инертный белок и чистого стрептавидина , которые по своим биохимическим и адсорбционным свойствам полностью соответствуют исходным немеченым веществам. Перечень фигур чертежей Фиг 1. Медицинский радиоиммунный анализ тироксинсвязывающего глобулина. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а- калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 2. Медицинский иммунорадиометрический анализ альфа-фетопротеина. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. 4248 1 Фиг 3. Медицинский радиоиммуноанализ эстрадиола. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 4. Медицинский иммуноферментный анализ трийодтиронина. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 5. Медицинский иммунолюминометрический анализ тестостерона. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 6. Медицинский иммунорадиометрический анализ ферритина. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 7. Медицинский иммуноферментный анализ аутоантител к тиреопероксидазе. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способу-прототипу а- калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Фиг 8. Медицинский иммунорадиометрический анализ аутоантител к тиреоглобулину. 1 - разделяющий твердофазный реагент по заявляемому способу 2 - разделяющий твердофазный реагент по способупрототипу а - калибровочные кривые б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой. Для лучшего понимания сущности изобретения приводятся конкретные примеры его выполнения, не ограничивающие сущности изобретения. Во всех этих примерах параллельно с заявляемым способом осуществляют способ-прототип по описанной для него методике 4 с использованием необработанных пластмассовых изделий и тех же материалов для биопокрытия, что описаны в конкретном примере для заявляемого способа. Полученные по способу-прототипу целевые продукты испытывают в тех же экспериментальных условиях, что и соответствующие продукты по заявляемому способу. Пример 1. Получение разделяющего твердофазного реагента для радиоиммунного анализа (РИА) тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ) путем обработки полистирольных пробирок. Партию пробирок Бион (100 шт) помещают в полиэтиленовый мешок и подвергают действию гаммаизлучения от изотопа 60 Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (20 ч), достаточного для поглощения дозы 100 кГр. После извлечения из контейнера все пробирки одновременно обрабатывают в одном технологическом режиме с использованием аппаратов для дозированного распределения жидкостей и промывки. В пробирки вносят по 1,0 мл 96 -ного этилового спирта, выдерживают в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, органический растворитель полностью удаляют и пробирки промывают дважды дистиллированной водой по 4 мл. Далее пробирки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение двух слоев биопокрытия из конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка. Вариант 1. В пробирки приливают по 1,0 мл раствора 10 мкг/мл конъюгата БСА-биотин и 0 или около 2 кБк/мл 125 БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют при постоянном встряхивании на вибрационном смесителе 2 ч при 37 С, а затем жидкость из пробирок удаляют, промывают дважды дистиллированной водой(по 1 мл),один раз 1 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1 Ми 0,02 Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 1 мл). В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 кБк/мл 125 стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют 2 ч при температуре 37 С, а затем жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. В пробирки добавляют по 0,5 мл свежеприготовленного раствора 0,5 мг/мл глутарового альдегида в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют при постоянном встряхивании 1 ч при 37 С, жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Вариант 2. В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 200 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 кБк/мл 125 стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют 2 ч при температуре 37 С, а затем жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Далее пробирки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково. В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 50 мг/мл сахарозы и 1 мг/мл БСА в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), выдерживают в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, жидкость полностью удаляют, приливают по 1,0 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, выдерживают 10 мин.,жидкость полностью удаляют и сушат пробирки в сушильном шкафу с внутренней принудительной вентиляцией при 37 С в течение 4 ч. 5 4248 1 Анализ целевых продуктов проводят путем измерения общей активности радиоиндикаторов (125 БСАбиотина или 125 стрептавидина) в первом или втором биослоях. Конечные продукты испытывают в радиоиммуноанализе ТСГ с применением компонентов и модифицированной методики серийного жидкофазного набора РИА-ТСГ, в котором антисыворотка к ТСГ заменена на биотинилированные аффинно-очищенные поликлональные антитела к ТСГ. Кроме того, подвергают полученный твердофазный реагент тесту на ускоренное старение и тесту на экстремальные воздействия. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-6 и на рис. 1. Экспериментальное сравнение целевых продуктов показывает, что заявляемый способ дает покрытые пробирки, содержащие в 1,5-3 раза большее количество стрептавидина, чем существующий способ (табл. 1 и 2). Это происходит за счет улучшенной физической адсорбции белка (табл. 1) или большей доступности остатков биотина в предыдущем слое (табл. 2). Разделяющий твердофазный реагент для радиоиммуноанализа ТСГ, полученный по заявляемому способу,имеет в 3 раза большую емкость (табл. 3) и в 2,5 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания комплекса биотинилированное антитело-антиген, устойчивее на 5 при хранении в естественных условиях(табл. 5) и в 1,3-2 раза при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Система для медицинского микроанализа РИА-ТСГ на основе разделяющего твердофазного реагента,полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способупрототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 1). Пример 2. Получение разделяющего твердофазного реагента для иммунорадиометрического анализа(ИРМА) альфа-фетопротеина (АФП) путем обработки полистирольных пробирок. Заявляемый способ применяют, как описано в примере 1, со следующими изменениями. На стадии физико-химической обработки используют пробирки ЕКау, поглощенная доза гаммарадиации составляет 50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ледяную уксусную кислоту. В варианте 1 на стадии формирования первого слоя покрытия раствор 5 мкг/мл конъюгата биотиниммуноглобулин быка инкубируют без встряхивания в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, а на стадии нанесения второго слоя покрытия раствор 20 мкг/мл стрептавидина инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре. На стадии химической стабилизации встряхивание с раствором 0,2 мг/мл глутарового альдегида проводят 2 ч при комнатной температуре. В варианте 2 прямую иммобилизацию стрептавидина ведут в течение 14-18 ч из раствора с концентрацией 40 мкг/мл. На стадии физической стабилизации пробирки обрабатывают раствором 50 мг/мл лактозы и сушат в течение ночи (14-18 ч) под вакуумом (остаточное давление менее 0,1 торр ) при комнатной температуре. Проводят испытания продуктов, как описано в примере 1, и испытывают конечный твердофазный реагент в иммунорадиометрическом анализе АФП с применением компонентов и модифицированной методики лабораторной системы ИРМА-АФП, включающей использование биотинилированных моноклональных антител к АФП. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-6 и на рис. 2. Разделяющий твердофазный реагент для иммунорадиометрического анализа АФП, полученный по заявляемому способу, имеет в 3 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,2 раза меньший коэффициент вариации(табл. 4) связывания комплекса биотинилированное антитело-антиген, устойчивее на 5 при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 1,3-2 раза при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Система для медицинского микроанализа ИРМА-АФП на основе разделяющего твердофазного реагента,полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу,так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений(рис. 2). Пример 3. Получение разделяющего твердофазного реагента для РИА эстрадиола (Е 2) путем обработки полистирольных пробирок. Заявляемый способ применяют как описано в примере 1. Проводят испытания продуктов, как описано в примере 1, и испытывают конечный твердофазный реагент в радиоиммунном анализе 2 применением компонентов и модифицированной методики серийного жидкофазного набора РИА-2, включающей использование аффинно-очищенного и биотинилированного ба 6 4248 1 раньего антителак иммуноглобулину кролика и необработанной поликлональной антисыворотки кролика к эстрадиолу. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-6 и на рис. 3. Разделяющий твердофазный реагент для радиоиммуноанализа 2, полученный по заявляемому способу, имеет в 2 раза меньший коэффициент вариации связывания комплекса биотинилированное антитело-антитело-антиген (табл. 4), устойчивее на 5 при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 1,3-2 раза при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Рабочая связывающая емкость покрытых пробирок в случае иммуноанализа Е 2 гораздо ниже потенциальной связывающей емкости за счет намеренного использования очень малых количеств антител в жидкой фазе как в способе-прототипе, так и в заявляемом способе. Однако более равномерное распределение тройного комплекса биотинилированное антивидовое антитело - видовое анти-Е 2 антитело - Е 2 по высокоемкому слою биотинсвязывающего белка в пробирках, покрытых по заявляемому способу, обеспечивает низкую вариабельность результатов анализа. Система для медицинского микроанализа РИА-Е 2 на основе разделяющего твердофазного реагента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет низкую вариабельность определений (рис. 3). Пример 4. Получение разделяющего твердофазного реагента для иммуноферментного анализа (ИФА) трийодтиронина (Т 3) путем обработки лунок полистирольных микропланшетов. Партию микропланшетов(10 шт) помещают в полиэтиленовый мешок и подвергают действию гамма-излучения от изотопа 60 Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (5 ч), достаточного для поглощения дозы 25 кГр. После извлечения из контейнера все планшеты одновременно обрабатывают в одном технологическом режиме с использованием полуавтоматического 8-канального дозатора жидкостей. Во все 96 (8 х 12) лунок микропланшета приливают по 0,3 мл концентрированной муравьиной кислоты, выдерживают в течение ночи (14-16 ч) при комнатной температуре, органический растворитель полностью удаляют и лунки промывают дистиллированной водой дважды по 0,3 мл. Далее лунки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение двух слоев биопокрытия из конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка. Вариант 1. Во все лунки микропланшета приливают по 0,3 мл раствора 10 мкг/мл конъюгата БСАбиотин и 0 или около 2 кБк/мл 125 БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют при постоянном встряхивании на вибрационном смесителе 2 ч при 37 С, а затем жидкость из пробирок удаляют, промывают дважды дистиллированной водой (по 0,3 мл), один раз 1 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1 Ми 0,02 Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 0,3 мл). Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 50 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 КБ/мл 125 стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют с постоянным встряхиванием 2 ч при температуре 37 С, а затем жидкость из лунок микропланшета удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Во все лунки добавляют по 0,2 мл свежеприготовленного раствора 0,1 мг/мл глутарового альдегида в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащего 1 мг/мл БСА, инкубируют при постоянном встряхивании 1 ч при 37 С, жидкость из лунок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Вариант 2. Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 КБ/мл 125 стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют с постоянным встряхиванием 2 ч при температуре 37 С, а затем жидкость из лунок микропланшета удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Далее лунки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково. Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 20 мг/мл поливинилпирролидона и 1 мг/мл БСА в 0,05 М натрийфосфатном буфере (рН 7,5), выдерживают в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, жидкость полностью удаляют, приливают по 0,3 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, выдерживают 10 мин., жидкость полностью удаляют и сушат микропланшеты в сушильном шкафу с внутренней принудительной вентиляцией при 37 С в течение 4 ч. Проводят испытания продуктов, как описано в примере 1, и испытывают конечный твердофазный реагент в иммуноферментном анализе Т 3 с применением компонентов и модифицированной методики лабораторной системы ИФА-Т 3, включающей использование аффинно-очищенного и биотинилированного бараньего антителак иммуноглобулину кролика и необработанной поликлональной антисыворотки кролика к Т 3. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-5 и на рис. 4. Разделяющий твердофазный реагент для радиоиммуноанализа Т 3, полученный по заявляемому способу, имеет в 1,7 раза меньший коэффициент вариации связывания комплекса антитело-антиген 7(табл. 4) и устойчивее на 18 при хранении в естественных условиях (табл. 5), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Рабочая связывающая емкость покрытых лунок в случае иммуноанализа Т 3 гораздо ниже потенциальной связывающей емкости за счет намеренного использования очень малых количеств антител в жидкой фазе как в способе-прототипе, так и в заявляемом способе. Однако более равномерное распределение тройного комплекса биотинилированное антивидовое антитело - видовое анти-Т 3 антитело -Т 3 по высокоемкому слою биотинсвязывающего белка в лунках, покрытых по заявляемому способу, обеспечивает низкую вариабельность результатов анализа. Система для медицинского микроанализа ИФА-Т 3 на основе разделяющего твердофазного реагента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более низкую вариабельность определений (рис. 4). Пример 5. Получение разделяющего твердофазного реагента для иммунолюминометрического анализа(ИЛМА) тестостерона путем обработки лунок полистирольных микропланшетов. Заявляемый способ применяют, как описано в примере 4, со следующими изменениями. На стадии физико-химической обработки микропланшетов поглощенная доза гамма-радиации составляет 50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ацетонитрил. В варианте 1 раствор 2 мкг/мл конъюгата БСА-биотин инкубируют без встряхивания в течение ночи (1418 ч) при комнатной температуре, для нанесения второго слоя покрытия раствор 20 мкг/мл стрептавидина инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре, а химическую стабилизацию осуществляют путем встряхивания с раствором 0,3 мг/мл глутарового альдегида в течение 2 ч при комнатной температуре. В варианте 2 раствор 40 мкг/мл стрептавидина инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре. На стадии физической стабилизации после обработки микропланшетов стабилизирующими растворами и промывок осуществляют процесс высушивания в течение ночи (14-18 ч) под вакуумом (остаточное давление менее 0,1 торр ) при комнатной температуре. Проводят испытания продуктов, как описано в примере 1, испытывают конечный твердофазный реагент в иммунолюминометрическом анализе тестостерона с применением компонентов и модифицированной методики лабораторной системы ИЛМА-тестостерон, включающей использование биотинилированных очищенных моноклональных антител к тестостерону. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-5 и на рис. 5. Разделяющий твердофазный реагент для иммунолюминометрического анализа тестостерона, полученный по заявляемому способу, имеет в 4 раза меньший коэффициент вариации связывания комплекса антитело-антиген (табл. 4) и на 18 устойчивее при хранении в естественных условиях (табл. 5),чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Рабочая связывающая емкость покрытых лунок в случае иммуноанализа тестостерона гораздо ниже потенциальной связывающей емкости за счет намеренного использования очень малых количеств антител в жидкой фазе как в способе-прототипе,так и в заявляемом способе. Однако более равномерное распределение комплекса биотинилированное антитело - тестостерон по высокоемкому слою биотинсвязывающего белка в лунках, покрытых по заявляемому способу, обеспечивает низкую вариабельность результатов анализа. Система для медицинского микроанализа ИЛМА-тестостерон на основе разделяющего твердофазного реагента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет низкую вариабельность определений (рис. 5). Пример 6. Получение разделяющего твердофазного реагента для ИРМА ферритина путем обработки турбинок из композита полиэтилена и полипропилена. Партию (100 шт) турбинокпомещают в полиэтиленовый мешок и подвергают действию гаммаизлучения от изотопа 60 Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (5 ч), достаточного для поглощения дозы 25 кГр. После извлечения из контейнера все турбинки помещают в колбу и обрабатывают различными растворами при постоянном перемешивании на ротационном смесителе. В колбу добавляют 50 мл диметилсульфоксида, инкубируют в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре,органический растворитель удаляют и промывают турбинки дистиллированной водой дважды по 50 мл. Далее турбинки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение двух слоев биопокрытия из конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка. Вариант 1. На стадии формирования первого биослоя в колбу вносят 50 мл раствора 5 мкг/мл конъюгата БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют 4 ч при комнатной температуре, а затем жидкость из колбы удаляют, промывают турбинки дважды дистиллированной водой (по 50 мл), один раз 50 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1 Ми 0,02 Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 50 мл). 4248 1 На следующей стадии в колбу прибавляют 50 мл раствора 50 мкг/мл стрептавидина в 0,05 М натрийбикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют 4 ч при комнатной температуре, а затем жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. На стадии химической стабилизации в колбу добавляют 50 мл свежеприготовленного раствора 0,2 мг/мл глутарового альдегида в 0,05 М натрий-фосфатномбуфере (рН 7,5), содержащего 1 мг/мл БСА, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Вариант 2. В колбу прибавляют 50 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина в 0,05 М натрийбикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют 4 ч при комнатной температуре, а затем жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Далее турбинки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково. На стадии физической стабилизации в колбу вносят 50 мл раствора 100 мг/мл сахарозы и 1 мг/мл БСА в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), инкубируют 4 ч при комнатной температуре, жидкость полностью удаляют, приливают 50 мл раствора 2 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, инкубируют 10 мин.,жидкость полностью удаляют, турбинки переносят в сушильный шкаф с внутренней вентиляцией и выдерживают 4 ч при 37 С. Проводят испытания полученного твердофазного реагента в иммунорадиометрическом анализе ферритина с применением компонентов и модифицированной методики серийного жидкофазного набора ИРМА-ферритин, включающей биотинилированные аффинно-очищенные бараньи антитела ккролика и аффинно-очищенные кроличьи антителак ферритину. Кроме того, подвергают реагент тесту на ускоренное старение и тесту на экстремальные воздействия. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-6 и на рис. 6. Разделяющий твердофазный реагент для иммунорадиометрического анализа ферритина,полученный по заявляемому способу, имеет в 2,6 раза большую емкость (табл. 3) и в 2 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания комплекса биотинилированное антитело-антитело-антиген, устойчивее на 8 при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 3 раза при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Система для медицинского микроанализа ИРМА-ферритин на основе разделяющего твердофазного реагента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способупрототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 6). Пример 7. Получение разделяющего твердофазного реагента для ИФА аутоантител к тиреопероксидазе (АтТПО) путем обработки лунок полистирольных микропланшетов. Заявляемый способ применяют, как описано в примере 4, со следующими изменениями. На стадии физико-химической обработки микропланшетов поглощенная доза гамма-радиации составляет 50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ацетонитрил. В варианте 1 на стадии формирования первого слоя покрытия раствор 3 мкг/мл конъюгата овальбуминбиотин инкубируют без встряхивания в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре. На стадии нанесения второго слоя покрытия раствор 30 мкг/мл стрептавидина инкубируют 4 ч при комнатной температуре. В варианте 2 раствор 60 мкг/мл стрептавидина инкубируют 4 ч при комнатной температуре. На стадии физической стабилизации лунки планшета обрабатывают раствором 20 мг/мл сахарозы в 0,05 М трис- буфере (рН 7,4), содержащем 1 мг/мл БСА, в течение ночи при 4 С. Жидкость удаляют, приливают по 0,3 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. После удаления жидкости планшеты высушивают в течение ночи под вакуумом (остаточное давление менее 0,1 торр) при комнатной температуре. Полученный разделяющий твердофазный реагент испытывают в ИФА с применением компонентов и модифицированной методики стандартного набора реактивов ТРО(Биокод, Бельгия), включающей использование конъюгата биотин-ТПО и мечение связанного антитела из крови человека антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом. Кроме того подвергают реагент тесту на ускоренное старение. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-5 и на рис. 7. Разделяющий твердофазный реагент для иммуноанализа аутоантител к ТПО, полученный по заявляемому способу, имеет в 1,5 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,5 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания комплекса биотинилированный антиген - антитело, устойчивее на 18 при хранении в естественных условиях (табл. 5). Система для медицинского микроанализа ИФА-АтТПО на основе разделяющего твердофазного реагента,полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного твердофазного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 7). 4248 1 Пример 8. Получение разделяющего твердофазного реагента для ИРМА аутоантител к тиреоглобулину(АтТг) путем обработки турбинок из композита полиэтилена и полипропилена. Заявляемый способ применяют, как описано в примере 6, со следующими изменениями. На стадии физико-химической обработки турбинок поглощенная доза гамма-радиации составляет 50 кГр,а в качестве органического растворителя применяют муравьиную кислоту. В варианте 1 на стадии формирования первого биослоя в колбу вносят 50 мл раствора 5 мкг/мл конъюгата БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1) и инкубируют в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре. На следующей стадии турбинки обрабатывают раствором 50 мкг/мл стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1) в течение 2 ч при 37 С. В варианте 2 используют раствор 100 мкг/мл стрептавидина. Проводят испытания полученного разделяющего твердофазного реагента в ИРМА с применением компонентов и модифицированной методики лабораторной системы ИРМА-АтТг, включающей использование конъюгата биотинтиреоглобулин и мечение связанного антитела из крови человека радиойодированным белком А. Кроме того, твердофазный реагент подвергают тесту на ускоренное старение. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-5 и на рис. 8. Разделяющий твердофазный реагент для ИРМА аутоантител к тиреоглобулину, полученный по заявляемому способу, имеет в 1,7 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,5 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания комплекса биотинилированный антиген - антитело, устойчивее на 8 при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 3 раза при экстремальных воздействиях. Система для медицинского микроанализа ИРМА-АтТг на основе разделяющего твердофазного реагента,полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного твердофазного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 8). Таблица 1 Физическая адсорбция специфического биотинсвязывающего белка (стрептавидина) 4248 1 Таблица 3 Связывающая емкость разделяющих твердофазных реагентов в отношении биотинилированных комплексов антитело-антиген Вариабельность связывания биотинилированных комплексов антитело-антиген разделяющими твердофазными реагентами Пример Указан для пробы контрольной сыворотки, сертифицированной Государственным НИИ лекарственных средств и контрольных сывороток, МЗМП РФ. Таблица 5 Устойчивость разделяющих твердофазных реагентов при хранении в естественных условиях Пример Для свежеприготовленных твердофазных реагентов исходные значения параметра, характеризующего емкость (ВМАХ) связывания антигена (антитела), приняты за 100 . 4248 1 Таблица 6 Устойчивость разделяющих твердофазных реагентов при экстремальных воздействиях Пробирки Бион 1-й слой Пробирки ЕКау 2-й слой Турбинки 2-й слой Приведено количество радиомеченого компонента, удаленного из соответствующего биослоя конечного твердофазного реагента в результате экстремального воздействия (вк начальному содержанию компонента). Таким образом приведенные примеры подтверждают существенные отличия, положительные эффекты и полезность заявляемого способа для иммуноанализа антигенов различных классов (стероиды, йодтиронины,белки) с широким диапазоном молекулярных масс (360 дальтон-400 000 дальтон) и для иммуноанализа аутоантител в системах разных типов (РИА, ИРМА, ИФА, ИЛМА) с использованием нескольких наиболее распространенных форм твердофазных носителей (пробирки, микропланшеты, миниатюрные турбинки),изготовленных из разных видов пластмасс. Помимо использования в иммуноанализе, твердофазные носители, покрытые стрептавидином по заявляемому способу, могут широко применяться в прикладной биохимии и молекулярной биологии для извлечения биотинилированных макромолекул из сложных смесей. Источники информации 1.,,.,-/. 1987 .-. 46. - 8. - . 2548-2556. 2. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Твердое тело и полимеры. Прикладные аспекты. - . Наука, 1987. - С. 56-59, 350-355, 186-194. 3.., -/. . Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.