Способ определения концентрации тирозин- и триптофан-содержащих пептидов в плазме крови

(51)01 33/49 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ТИРОЗИН- И ТРИПТОФАН-СОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гаврилов Виктор Борисович Лобко Наталья Федоровна Гаврилова Алевтина Рудольфовна Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения концентрации тирозин- и триптофан-содержащих пептидов в плазме крови, заключающийся в том, что после осаждения белков плазмы хлорной кислотой доводятпробы до 13,0-13,1, определяют поглощение пробы при длинах волн 290,300 и 305 нм и рассчитывают концентрацию тирозин- и триптофан-содержащих пептидов- ТЗП и ТРП - в плазме крови в ммоль/л по формулам ТЗП 1,62 Д 2 - 0,28 Д 1 или ТЗП 0,33 Д 290 - 0,26,ТРП 0,25 Д 1 - 0,40 Д 2, Спектры УФ-поглощения супернатанта плазмы крови,полученного после осаждения белков 0,6 М хлорной кислотой,при разных(1 -7,4 2 -11,0 3 -13,0) 8588 1 2006.10.30 где Д 1 Д 290 - Д 305 Д 2 Д 300 - Д 305 Д 290, Д 300 и Д 305 - значения поглощения пробы, измеренные соответственно при 290,300 и 305 нм и рассчитанные с учетом разведения плазмы. Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к биохимическому анализу крови и может быть использовано для диагностики синдрома эндогенной интоксикации при инфекционно-септических, онкологических, эндокринных и травматических заболеваниях. В настоящее время степень эндогенной интоксикации (ЭИ) организма считают одним из важных критериев тяжести состояния больных при самых разных заболеваниях. Развитие ЭИ обусловлено образованием и последующим выходом из поврежденной ткани в кровь различных продуктов катаболизма, обладающих токсическим действием и вызывающих генерализацию локального патологического процесса. Все эндотоксины относятся к соединениям с низким и средним молекулярным весом, не превышающим 5000 Д, для измерения которых используют депротеинизированную плазму, получаемую путем осаждения белков с помощью трихлоруксусной (ТХУ) или хлорной (К) кислот. Их принято разделять на две большие группы - олигопептиды (ОП), образующиеся при протеолизе белков, и непептидные вещества с низкой и средней молекулярной массой , к которым относят около 200 соединений нормального и аномального метаболизма (аминокислоты, мочевина, креатинин, билирубин, лактат, фенолы и др.), накапливающихся в токсичных для организма концентрациях. Оба показателя эндотоксемии при сильной степени интоксикации возрастают в несколько раз. С целью быстрого и простого определения ОП предложен скрининг-метод, по которому их концентрацию оценивают непосредственно по величине ультрафиолетового (УФ) поглощения супернатанта (при 254 нм), полученного после осаждения белков 10 ТХУ и разведенного в 10 раз дистиллированной водой 1. Основным недостатком указанного метода является его низкая специфичность, так как в УФ-области помимо пептидов поглощают многие другие органические соединения, содержащиеся в плазме. Поэтому величину УФ-поглощения Д 254 многие авторы оценивают не как концентрацию ОП, а как интегральный показатель содержания молекул средней массыили всех веществ низкой и средней молекулярной массы . Прототипом предлагаемого изобретения является способ определения ОП, основанный на осаждении белков хлорной кислотой (4), разведении супернатанта дистиллированной водой и измерении его УФ-поглощения при 210 нм или 280 нм 2. Длина волны 210 нм соответствует максимуму поглощения пептидной связи, а 280 нм - максимуму поглощения ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и фенилаланина). В отличие от ТХУ хлорная кислота (ХК) не поглощает в ультрафиолетовой области и не влияет на УФ-поглощение измеряемых проб в области 210-260 нм. Установлено, что значение показателей Д 210 и Д 280 по сравнению с Д 254 значительно лучше коррелирует с содержанием ОП, измеряемым методом гель-фильтрации. Вместе с тем специфичность указанных показателей остается низкой. Эти показатели не позволяют оценить молярную или массовую концентрацию ОП и не учитывают вклад побочного поглощения непептидных веществ. В частности, показатель Д 280 характеризует лишь относительное изменение суммарного содержания ароматических остатков аминокислот в олигопептидах по отношению к норме. Для повышения чувствительности и точности анализа предложен метод, по которому регистрацию УФ-поглощения депротеинизированной плазмы проводят при рН 13,0-13,1 и вместо общего показателя оптического поглощения пропорционального суммарной концентрации ароматических аминокислот, определяют молярные концентрации отдельных пептидных фракций тирозин- и триптофан-содержащих пептидов (ТЗП и ТРП). 2 8588 1 2006.10.30 Отличительной сущностью предлагаемого способа определения ТЗП и ТРП в плазме крови путем осаждения белков плазмы хлорной кислотой и доведения рН пробы до 13,013,1 является определение поглощения пробы при длинах волн 290, 300 и 305 нм и расчет концентрации тирозин- и триптофан-содержащих пептидов - ТЗП и ТРП - в плазме крови в ммоль/л по формулам ТЗП 1,62 Д 2 - 0,28 Д 1 или ТЗП 0,33 Д 290 - 0,26,ТРП 0,25 Д 1 - 0,40 Д 2,где Д 1 Д 290 - Д 305 Д 2 Д 300 - Д 305 Д 290, Д 300 и Д 305 - значения поглощения пробы, измеренные соответственно при 290, 300 и 305 нм и рассчитанные с учетом разведения плазмы. Существенность предлагаемых операций и формул для определения содержания ТЗП и ТРП подтверждается следующими исследованиями и примерами. Было обнаружено, что при щелочном сдвиге рН супернатанта плазмы крови происходит увеличение оптической плотности и длинноволновое смещение максимума спектра поглощения в области 280 нм. Изменение этих показателей достигало максимальных значений при рН 13,0-13,1, при котором интенсивность поглощения возрастала на 20 по сравнению с нейтральным рН, а максимум спектра поглощения сдвигался с 280 до 290 нм(фиг. 1). Для объяснения обнаруженного эффекта был проведен анализ поглощения ароматических аминокислот и основных небелковых компонентов плазмы крови в концентрациях,соответствующих верхней границе их содержания в норме 3, 4 (табл. 1). Известно, что интенсивность УФ-поглощения при 280 нм падает в ряду триптофан - тирозин - фенилаланин соответственно в 4 и 28 раз 4. Следовательно, оптический сигнал плазмы крови в области 280-310 нм может быть представлен суммой поглощения только триптофана и тирозина, находящихся в виде свободных аминокислот и в составе пептидов. Установлено, что при щелочном рН (предлагаемый метод) по сравнению с нейтральным рН (известный метод) поглощение тирозина (Дтир) возрастает в 1,7 раза, поглощение триптофана(1,1 г/л глюкозы 0,5 г/л мочевины 0,76 мг/л АТФ) падает почти в 2 раза. Таблица 1 УФ-поглощение супернатанта плазмы крови и ее компонентов в условиях определения олигопептидов по известному методу (Д 280 нм, рН 6,5) и предлагаемому методу (Д 290 нм, рН 13) Показатели оптического поглощения компонентов плазмы Супернатант плазмы, Дпл/мл Тирозин (18,1 мг/л), Дтир Триптофан (15,3 мг/л), Дтрп Ароматические аминокислоты ДакДтирДтрп Небелковые вещества, Днб Олигопептиды, ДопДпл - (ДакДнб) При этом собственное поглощение ОП (Доп), вычисленное по разности между поглощением супернатанта плазмы Дпл и суммарным поглощением свободных ароматических аминокислот и небелковых веществ (ДакДнб), возрастает в 1,32 раза. Таким образом, измерение УФ-поглощения при щелочном рН позволяет во-первых,повысить чувствительность определения за счет резкого рН-зависимого усиления погло 3 8588 1 2006.10.30 щения тирозина и во-вторых, увеличить специфичность анализа в результате существенного снижения поглощения небелковых примесей. Считая, что концентрация пептидов в плазме крови преобладает по сравнению со свободными аминокислотами, общий тирозин и триптофан мы далее обозначили как тирозин- и триптофан-содержащие пептиды (соответственно ТЗП и ТРП). Количественный анализ смеси двух соединений по спектру оптического поглощения основан на измерении поглощения пробы и коэффициентов молярной экстинкции обоих соединений при двух длинах волн (1 и 2). При этом поглощение проб описывается уравнениями(2) Д 2 а 2 Са 2 С,где Д 1 и Д 2 - оптическое поглощение пробы при 1 и 2, Са и- молярные концентрации компонентов (А и В), 1 и 2 - коэффициенты молярной экстинкции компонента А при 1 и 2, 1 и 2 - коэффициенты молярной экстинкции компонента В при 1 и 2. Концентрация веществ, входящих в состав смеси, определяют по уравнениям Фирордта 5(4)(1 Д 2-2 Д 1)/(12-21). Для вычисления концентраций ТЗП и ТРП, входящих в состав пептидной фракции крови, нами были измерены коэффициенты молярной экстинкции тирозина и триптофана по растворам этих аминокислот при щелочном рН 13,0 при 3-х длинах волн 290 нм, 300 нм и 305 нм (табл. 2). Таблица 2 Коэффициенты молярной экстинкции (, л/моль-1 см-1) ароматических аминокислот тирозина и триптофана при рН 13,0 Аминокислота 290 (290 нм) 300 (300 нм) 305 (305 нм) 1290-305 2300-305 Тирозин (А) 2,5810-3 2,1010-3 1,2610-3 1,3210-3 0,8410-3 Триптофан (В) 6,0510-3 1,5510-3 0,6310-3 5,4210-3 0,9210-3 Подставив численные значения соответствующих коэффициентов, нами были выведены уравнения для определения концентрации ТЗП и ТРП для двух пар длин волн 1) 1290 нм и 2300 нм ТЗП 1 (ммоль/л)0,70 Д 300 - 0,18 Д 290(5) ТРП 1 (ммоль/л)0,24 Д 290 - 0,30 Д 300,где Д 290 и Д 300 - удельное поглощение на 1 мл плазмы. 2) 1290 нм и 2305 нм ТЗП 2 (ммоль/л)Д 305 - 0,11 Д 290(8) Указанные уравнения были использованы для расчета концентрации ТЗП и ТРП по значениям оптической плотности плазмы крови здоровых доноров (табл. 3). Очевидно, что при достоверности формул (5-8) концентрации ТЗП и ТРП, измеренные двумя способами, должны совпадать. Однако значения ТЗП и ТРП, измеренные по первому способу (по Д 290 и Д 300), были существенно выше значений, измеренных по второму способу (по Д 290 и Д 305). Таким образом, уравнения (5-8) дают неверные значения концентраций ТЗП и ТРП, возможно за счет влияния дополнительного фонового поглощения непептидных компонентов. Чтобы смоделировать влияние фонового поглощения на измеряемые концентрации пептидов, из всех показателей оптического поглощения была вычтена величина фона, принятая за 10 и 20 от уровня Д 305. 4 8588 1 2006.10.30 Таблица 3 Концентрации тирозин- и триптофан-содержащих пептидов (ТЗП и ТРП),вычисленные по формулам (5-8) без и с коррекцией на поглощение фона Коррекция Д 290 Д 300 Д 305 ТЗП 1,ТЗП 2,ТРП 1,ТРП 2, ТЗП 2/ТЗП 1,оптического по(ед/мл) (ед/мл) (ед/мл) ммоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л глощения Без коррекции (1) 4,15 3,27 2,33 1,54 1,87 0,015-0,08 117 Фон (0,2 Д 305)(Х 3) 3,68 2,57 1,63 1,14 1,22 0,112 0,07 108 Отношение показателей Х 3/Х 1,8979707465747 После коррекции значения ТЗП 1 и ТЗП 2 снижались соответственно до 74 и 65 от исходных величин. При этом разница между ними существенно снижалась. Одновременно многократно в 7,5 раза повышалась концентрация ТРП 1. Аналогично возрастал показатель ТРП 2, значение которого было отрицательным при расчете без коррекции и становилось положительным после коррекции фонового поглощения. Таким образом, фоновое поглощение непептидных компонентов значительно завышает расчетный уровень ТЗП и многократно снижает расчетный показатель ТРП. Для коррекции фонового поглощения непептидных компонентов, нами предложены новые формулы расчета концентраций ТЗП и ТРП по спектру поглощения плазмы, основанные на измерении оптической плотности пробы при трех длинах волн 290 нм, 300 нм и 305 нм и вычислении разностных величин Д 1 Д 290-Д 305 и Д 2 Д 300-Д 305(9) ТЗП(2 Д 1 - 1 Д 2) / (12 - 21) ТРП(1 Д 2 - 2 Д 1) / (12 - 21), (10) где 1290-305 и 2300-290 разность коэффициентов молярной экстинкции для тирозина, 1290-305 и 2300-290 аналогичные показатели для триптофана. Подстановка разностных значений коэффициентов молярной экстинкции тирозина и триптофана, взятых из таблицы 2, приводит к следующим уравнениям для расчета концентрации пептидных фракций(12) ТРП (ммоль/л)0,25 Д 1 - 0,40 Д 2. С использованием указанных формул были вычислены концентрации ТЗП и ТРП в норме, а также у больных с инсультом и при раке щитовидной железы (табл. 4). Таблица 4 Показатели оптического поглощения плазмы крови и концентрация ТЗП и ТРП в норме и патологии Здоровые доноры Рак щитовидной Показатель Инсульт (16) 8588 1 2006.10.30 Как видно из табл. 4, в норме содержание ТЗП почти в 13 раз выше, чем ТРП. Сопоставление ТЗП и ТРП со средними концентрациями показывает, что вклад пептидной фракции в общее содержание тирозина составляет 94 , а в содержание триптофана 38 . При патологии концентрация ТЗП возрастала в 2,8 раза при раке щитовидной железы и в 2,77 раза при инсульте. Концентрация ТРП возрастала в меньшей степени - в 2,0 раза при раке щитовидной железы и всего лишь на 13 при инсульте. Таким образом,значение ТРП многократно уступает значению ТЗП по чувствительности (абсолютной величине) и диагностической значимости. Поэтому практический смысл в медицинской диагностике имеет определение концентрации только первой пептидной фракции - ТЗП. Для упрощения способа определения ТЗП была измерена корреляционная зависимость между содержанием ТЗП и упрощенными оптическими показателями - (Д 290-Д 305) (фиг. 2) и Д 290 (фиг. 3). Был выявлен высокий уровень корреляции между ТЗП и указанными показателями - 087 между ТЗП и (Д 290-Д 305) и 0,95 между ТЗП и Д 290. Выявленная корреляция позволяет проводить вычисления ТЗП по упрощенным формулам, только по измерению Д 290 и Д 305, либо только по измерению Д 290. С учетом более высокого значения корреляции и простоты анализа, предпочтительным является использование показателя Д 290. Уравнение для расчета концентрации ТЗП было выведено с помощью метода наименьших квадратов ТЗП (ммоль/л)0,33 Д 290 - 0,26.(13) Предлагаемый способ осуществляется следующим способом в пластиковую пробирку на 1,5 мл последовательно добавляют 0,2 мл плазмы крови и 0,4 мл 0,6 хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 2-3 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Затем отбирают 0,4 мл супернатанта, добавляют 1,6 мл 0,7 раствора(рН смеси составляет 13,0-13,1) и измеряют оптическую плотность пробы (ДХ) при 290 нм, 300 нм и 305 нм в 1-см кварцевой или пластиковой кювете на стандартном спектрофотометре. В контрольной пробе смешивают 0,4 мл 0,6 хлорной кислоты и 1,6 мл 0,7 и измеряют оптическую плотность ДО, в тех же условиях. Затем вычисляют разность оптических плотностей ДизмД-Д и рассчитывается показатель удельного поглощения пробы на мл плазмы (опт.ед./мл) по формуле ДДизм 1/пл 2/Дизм 0,6/0,22,0/0,415 Дизм, где пл - объем плазмы,- объем супернатанта, 1 и 2 общие объемы пробы после смешивания плазмы с раствором К (1) и смешивания супернатанта с раствором(2). Расчет концентрации ТЗП проводят по уравнению(11), либо по упрощенной формуле (13). Концентрацию ТРП вычисляют по формуле (12). Пример 1. Определение ТЗП в плазме крови здорового донора. В пластиковую пробирку на 1,5 мл добавляют 0,2 мл плазмы крови здорового донора и 0,4 мл 0,6 хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 2-3 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Затем отбирают 0,4 мл супернатанта в пластиковую пробирку на 4 мл, добавляют к нему 1,6 мл 0,7 раствора , перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы (Дизм) в 1 см кварцевой кювете на стандартном спектрофотометре при 290 нм, 300 нм и 305 нм (соответственно, Д 10,354,Д 20,279, Д 30,188). В контрольной пробе 0,3 мл 0,9 хлорной кислоты добавляют к 1,7 мл 0,7 и измеряют оптическую плотность (ДО 0,014) в тех же условиях. Расчет удельного поглощения пробы на 1 мл плазмы при длине волны(Д) проводят по уравнению Д 15(Дизм-ДО). При этом Д 2905,52, Д 3004,40, Д 3053,04. Затем определяют Д 1 Д 290-Д 3052,48 и Д 2 Д 290-Д 3051,36. Полученные значения подставляют в уравнения для расчета ТЗП и ТРП и вычисляют ТЗП (ммоль/л)1,62 Д 2 - 0,28 Д 11,51 ТРП (ммоль/л)0,25 Д 1 - 0,40 Д 20,08. По упрощенному варианту определение ТЗП проводят путем измерения Д 290 и вычисления концентрации пептидов по формуле ТЗП (ммоль/л)0,33 Д 290-0,261,56. 6 8588 1 2006.10.30 Пример 2. Определение концентрации ТЗП в плазме крови больного с синдромом эндогенной интоксикации. В пластиковую пробирку на 1,5 мл добавляют 0,2 мл плазмы крови больного с инсультом, имеющего выраженный синдром эндогенной интоксикации, осаждают белки с помощью хлорной кислоты описанным выше способом. Затем супернатант разводят 0,7, измеряют оптическую плотность пробы при 290, 300 и 305 нм и вычисляют удельное поглощение пробы на 1 мл плазмы при указанных длинах волн Д 2908,72, Д 3006,89,Д 3054,72. Далее вычисляют значения Д 1 Д 290-Д 3057,0 и Д 2 Д 290-Д 3052,17 и с помощью уравнений (11-13) определяют концентрацию ТЗП и ТРП ТЗП (ммоль/л)1,62 Д 2-0,28 Д 12,39 ТРП (ммоль/л)0,25 Д 1-0,40 Д 20,13 ТЗП (ммоль/л)0,33 Д 290-0,262,61. Сопоставление предлагаемого способа со способом прототипом показывает, что в новом способе вместо относительного показателя, выражаемого в единицах оптической плотности и характеризующего общее содержание олигопептидов, определяют молярную концентрацию двух фракций пептидов - тирозин - и триптофан-содержанщх веществ(табл. 5). Ранее эти показатели плазмы крови вообще не определялись. Кроме того, при синдроме эндогенной интоксикации новый показатель ТЗП возрастает в 2,8 раза, тогда как показатель Д 280, измеренный известным способом, увеличивается только в 1,79 раза. Таким образом, измерение концентрации ТЗП вместо показателя УФпоглощения при 280 нм существенно повышает чувствительность и точность анализа и позволяет более адекватно интерпретировать нарушения белкового метаболизма при патологии. Разработанный способ может быть использован в медицинской диагностике для оценки выраженности токсемии у больных с синдромом эндогенной интоксикации и контроля за эффективностью детоксикационной терапии. Таблица 5 Содержание олигопептидов, измеренное по известному методу (280, рН 6),и концентрация ТЗП, измеренная предлагаемым методом, в плазме крови у здоровых доноров и при раке щитовидной железы Содержание олигопептиОбследованная группа ТЗП (ммоль/л) дов (Д 280, рН 6,5) Здоровые доноры (7) 0,1620,033 1,030,33 Рак щитовидной железы (5) 0,2890,035 2,880,53 Повышение показателя у больных 179280(вк норме) Перечень фигур чертежей. Фиг. 1. Спектры УФ-поглощения супернатанта плазмы крови, полученного после осаждения белков 0,6 хлорной кислотой, при разных рН (1 - рН 7,4 2 - рН 11,0 3 - рН 13,0)(Конечное разведение плазмы - 15 раз). Фиг. 2. Корреляционная зависимость между содержанием ТЗП (ммоль/л) и показателем УФ-поглощения плазмы (Д 290-Д 305), измеряемые предлагаемым способом, у здоровых доноров и больных с синдромом эндогенной интоксикации (25). Фиг. 3. Корреляционная зависимость между содержанием ТЗП (ммоль/л) и показателем УФ-поглощения плазмы Д 290, измеряемые предлагаемым способом, у здоровых доноров и больных с синдромом эндогенной интоксикации (25). 8588 1 2006.10.30 Источники информации 1. Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Кулаков Г.П. // Клин. медицина. - 1981. -10. С. 38-42. 2. Осипович В.К., Тупикова З.А., Маркелов И.М. // Лаб. дело. - 1987. -3. С. 221-224. 3. Лабораторные методы исследования в клинике. / Под ред. В.В. Меньшикова. - . Медицина, 1987. 4. Шарабчиев Ю.Т., Дубина Т.В. Показатели здоровья в цифрах и фактах. - Мн УП Юпоком, 2001. 5. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. - Л. Химия, 1986. - С. 200. 6. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. - . Мир, 1980. - С. 582. Корреляционная зависимость между содержанием ТЗП (ммоль/л) и показателем УФ-поглощения плазмы (Д 290-Д 305), измеряемыми предлагаемым способом, у здоровых доноров и больных с синдромом эндогенной интоксикации (25) Корреляционная зависимость между содержанием ТЗП (ммоль/л) и показателем УФ-поглощения плазмы Д 290, измеряемыми предлагаемым способом, у здоровых доноров и больных с синдромом эндогенной интоксикации (25) Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8