Способ определения олигопептидов в плазме крови

(51)01 33/49 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гаврилов Виктор Борисович Лобко Наталья Федоровна Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения олигопептидов в плазме крови, включающий осаждение белков с помощью трихлоруксусной или хлорной кислот с последующим центрифугированием и измерение оптической плотности супернатанта плазмы крови в ультрафиолетовой области спектра, отличающийся тем, что перед измерением в супернатант плазмы крови добавляют 0,7 М аОН до рН 13,0-13,1, оптическую плотность полученной пробы измеряют при длине волны 290 нм в кювете 1 см, а содержание олигопептидов определяют в пробе по формуле Д 2 Д 1-Д 0,где Д 2 - содержание олигопептидов в пробе Д 1 оптическая плотность пробы, содержащей супернатант плазмы крови Д 0 - оптическая плотность пробы, не содержащей супернатант. 8050 1 2006.04.30 Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к биохимическому анализу крови, и может быть использовано для диагностики синдрома эндогенной интоксикации при инфекционных, онкологических, эндокринных и травматических заболеваниях. Эндогенная интоксикация (ЭИ) является одним из ведущих патогенетических синдромов в развитии широкого спектра заболеваний. Усиление катаболических процессов в первичном очаге заболевания приводит к эндогенному образованию токсических продуктов распада тканей. Выход этих продуктов в кровь и распространение по организму вызывает генерализацию патологического процесса и общую интоксикацию организма. В настоящее время основным критерием выраженности токсемии считают содержание в крови среднемолекулярных пептидов - продуктов протеолиза белков с молекулярной массой 500 - 5000 Да, которые называют молекулами средней массы (МСМ) или олигопептидами (ОП). Наиболее точным методом определения ОП в плазме крови является метод гельфильтрации депротеинизированного образца на колонке с сефадексом -25 и количественное определение элюируемых пептидных фракций с молекулярной массой 500-5000 Да по поглощению при 210 нм 1. К сожалению, этот метод является очень трудоемким и длительным и используется только в научных исследованиях. Известен метод определения ОП, по которому их суммарное содержание определяют в депротеинизированной плазме с помощью реакции Лоури 2. Депротеинизацию плазмы проводят путем добавления к 1 мл плазмы 0,5 мл 15 трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 1,2 М хлорной кислоты (ХК) и осаждения белков с помощью центрифугирования. К недостаткам метода относятся его большая длительность и трудоемкость, а также чувствительность реакции Лоури к присутствию целого ряда небелковых соединений. По этим причинам указанный метод не получил распространения в клинических исследованиях. С целью быстрого и простого определения ОП предложен скрининг-метод, по которому их концентрацию оценивают непосредственно по величине ультрафиолетового (УФ) поглощения супернатанта (при длине волны 254 нм), полученного после осаждения белков 10 ТХУ и разведенного в 10 раз дистиллированной водой 3. Основным недостатком указанного метода является его низкая специфичность, так как в УФ-области помимо пептидов поглощают многие другие органические соединения, содержащиеся в плазме(мочевина, мочевая кислота, креатинин, нуклеотиды и др.). Поэтому величину УФпоглощения Д 254 разные авторы оценивают не как концентрацию ОП, а как интегральный показатель содержания молекул средней массы (МСМ) или всех веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ). Прототипом предлагаемого изобретения является способ определения содержания ОП, основанный на осаждении белков хлорной кислотой (НС 4), разведении супернатанта дистиллированной водой и измерении его УФ-поглощения при 210 нм или 280 нм (прототип 1) 1. Длина волны 210 нм соответствует максимуму поглощения пептидной связи,а 280 нм - максимуму поглощения ароматических аминокислот (тирозина и триптофана). В отличие от ТХУ хлорная кислота не поглощает в ультрафиолетовой области и не влияет на УФ-поглощение измеряемых проб в области 210-260 нм. Установлено, что значение показателей Д 210 и Д 280 прямо коррелирует с содержанием ОП, измеряемым методом гельфильтрации. С другой стороны, поглощение Д 254 не может служить индикатором содержания ОП из-за отсутствия корреляции между двумя этими показателями. Однако специфичность определения концентрации ОП по показателям Д 210 и Д 280 остается недостаточно высокой, о чем свидетельствуют средние значения коэффициентов корреляции между оптическими показателями и концентрацией ОП (коэффициенты корреляции составляли 0,58 и 0,45 соответственно). Исходя из сравнения величин оптического поглощения, коротковолновый вариант измерения ОП по 210 более чем в 5 раз превосходит по чувствительности длинноволновый вариант (измерение Д 280). Поэтому в клинических исследованиях в основном измеряют показатель Д 210. Кроме того, как показали наши иссле 2 8050 1 2006.04.30 дования, измерение ОП по поглощению Д 280 указанным способом характеризует содержание только триптофановых остатков в пептидах. Для повышения специфичности определения ОП в плазме крови предложен метод, по которому после первичного осаждения белков с помощью хлорной кислоты проводят досаждение высокомолекулярных соединений 80 этанолом и измеряют содержание ОП по поглощению супернатанта при 210 нм (прототип 2) 4. Недостатком метода является увеличение трудоемкости и длительности анализа из-за необходимости проведения дополнительной операции осаждения. Отличительной сущностью предлагаемого способа определения ОП в плазме крови путем осаждения белков с помощью трихлоруксусной или хлорной кислот и измерения оптической плотности супернатанта плазмы крови является регистрация оптической плотности пробы при длине волны 290 нм и рН 13,0-13,1. По сравнению с известными прототипами предлагаемый способ более прост, имеет в 1,3 раза большую чувствительность и более точно измеряет суммарное содержание триптофановых и тирозиновых остатков в пептидах. Существенность предлагаемых условий для определения содержания ОП подтверждается следующими исследованиями и примерами. Установлено, что обработка 80 этанолом супернатанта плазмы крови, полученного после осаждения белков 0,6 М хлорной кислоты, и отделение осадка действительно резко снижает величину поглощения при 210 нм (Д 210) на 43 , но практически не влияет на величину поглощения при 280 нм (Д 280) (снижение на 5 ) (табл. 1). Очевидно, что при осаждении белков снижение оптической плотности должно происходить в одинаковой степени как при 210 нм, так и при 280 нм. Так как уменьшение оптической плотности после обработки образца 80 этанолом наблюдалось только при 210 нм, то этот эффект можно объяснить не осаждением белков, а удалением других органических соединений, которые имеют максимум поглощения в области 210 нм и не поглощают в области 280 нм. К таким соединениям относится широкий ряд веществ,содержащих бензольные кольца, карбонильные и карбоксильные группы, в частности жирные кислоты, некоторые углеводы и липиды. Практическим следствием обнаруженного эффекта является возможность измерения ОП по поглощению Д 280 без дополнительного осаждения УФ-поглощающих веществ этанолом, что значительно упрощает анализ. Таблица 1 Показатели оптической плотности супернатанта плазмы крови Д 210 и Д 280 после обработки плазмы 0,6 М хлорной кислоты (ХК) и 80 этанолом Впервые обнаружено, что при щелочном сдвиге рН супернатанта плазмы крови происходит увеличение оптической плотности и длинноволновое смещение максимума поглощения в области 280 нм. Изменение этих показателей достигало максимальных значений при рН 13,0-13,1, при котором интенсивность поглощения возрастала на 20 по сравнению с нейтральным рН, а максимум поглощения сдвигался с 280 нм до 290 нм(рисунок). Анализ поглощения ароматических аминокислот и основных небелковых компонентов плазмы крови в концентрациях, соответствующих верхней границе нормы 5, 6, показал, что при измерении их поглощения предлагаемым методом по сравнению с известным поглощение тирозина (Дтир) возрастает в 1,7 раза, поглощение триптофана (Дтрп) снижа 3 8050 1 2006.04.30 ется на 30 , а суммарное поглощение небелковых компонентов (глюкозы, мочевины и АТФ - Днб) падает почти в 2 раза (табл. 2). Таблица 2 Оптическое поглощение плазмы крови и ее компонентов в условиях определения олигопептидов по известному методу (280 нм и рН 6,5) и предлагаемому методу (290 нм, рН 13,0) Показатели оптического поглощения компонентов плазмы Супернатант плазмы(Дпл/мл) Тирозин (Дтир) Триптофан (Дтрп) Глюкоза (Дг) Мочевина (Дм) АТФ (Да) ДакДтирДтрп нб ДопДпл-Дак-Днб При этом собственное поглощение ОП (Доп) возрастает в 1,32 раза. Рост Доп обусловлен двумя причинами 1) резким рН-зависимым усилением поглощения тирозина и 2) существенным снижением поглощения небелковых примесей за счет сдвига волны измерения в длинноволновую сторону. Изменение вклада тирозина и триптофана в суммарное поглощение супернатанта плазмы крови в предлагаемом способе существенно улучшает точность определения ОП. Очевидно, что максимальная точность определения ОП должна соответствовать условиям, когда каждая аминокислота вносит равный вклад в измеряемый оптический сигнал. Измерение поглощения Д 280 заведомо снижает точность определения ОП, так как характеризует содержание только ароматических аминокислот и не чувствительно к содержанию других аминокислотных остатков. Более того, в известном способе чувствительность сигнала к триптофану более чем в 5 раз выше, чем к тирозину (табл. 3). Таблица 3 Удельное поглощение тирозина и триптофана и вклад этих аминокислот в УФ-поглощение плазмы крови при измерении по известному методу (280 нм,рН 6,5) и предлагаемому методу (290 нм, рН 13,0) Показатели оптического поглощения Триптофан (Трп) Тирозин (Тир) Трп/Тир В результате поглощение ароматических аминокислот в плазме крови в норме на 82 состоит из поглощения триптофана (Трп) и лишь на 18- из поглощения тирозина (Тир),то есть известный метод фактически моноспецифичен к содержанию триптофана и триптофановых остатков в пептидах. В предлагаемом способе удельное поглощение Трп и Тир 4 8050 1 2006.04.30 значительно выравнивается и относительная чувствительность Трп/Тир 2,19. В плазме крови вклад Трп в поглощение ароматических аминокислот в предлагаемом способе снижается до 65 , а вклад Тир повышается до 35 . Таким образом, в отличие от известного предлагаемый способ более точно характеризует суммарное содержание ароматических аминокислотных остатков в пептидах. Предлагаемый способ осуществляется следующим способом в пластиковую пробирку на 1,5 мл последовательно добавляют 0,2 мл плазмы крови и 0,1 мл 24 трихлоруксусной кислоты или 1,8 М хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Отбирают 0,2 мл супернатанта, добавляют 1,8 мл 0,7 М( смеси 13,0-13,1) и измеряют оптическую плотность пробы при 290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре. Пример 1. Определение олигопептидов в плазме крови здорового донора. В пластиковую пробирку на 1,5 мл добавляют 0,2 мл плазмы крови здорового донора и 0,1 мл 24 трихлоруксусной кислоты или 1,8 М хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Отбирают 0,2 мл супернатанта в пластиковую пробирку на 4 мл, добавляют к нему 1,8 мл 0,7 М , перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы (Д 10,120) при 290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре. В контрольной пробе 0,1 мл 24 трихлоруксусной кислоты или 1,8 М хлорной кислоты добавляют к 1,9 мл 0,7 Ми измеряют оптическую плотность (Д 00,014) в тех же условиях. Содержание олигопептидов оценивают по разности оптических плотностей Д 2 Д 1-Д 00,1200,0140,106. Пример 2. Определение концентрации олигопептидов в плазме крови больного с синдромом эндогенной интоксикации. В пластиковую пробирку вносят 0,2 мл плазмы крови больного туберкулезом легких с синдромом эндогенной интоксикации и осаждают белки с помощью хлорной кислоты описанным выше способом. В опытной пробе к 0,2 мл супернатанта к 0,2 мл супернатанта добавляют 1,8 мл 0,7 М , перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы(Д 10,186) при 290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре. Содержание олигопептидов оценивают по разности оптических плотностей опытной и контрольной проб Д 2 Д 1-Д 00,186-0,0140,172. Сопоставление предлагаемого способа со способом-прототипом показало следующие преимущества. 1. Упрощение анализа. По сравнению с известным способом (прототип 1 и 2) установлено, что при измерении показателя Д 280, но не показателя Д 210, можно исключить операцию второго осаждения непептидных компонентов с помощью этанола без существенного изменения специфичности анализа. 2. Увеличение чувствительности определения ОП в 1,3 раза. Для сравнительного анализа чувствительности двух методов определения ОП было проведено обследование плазмы крови здоровых доноров и больных туберкулезом легких со 2-3-й степенью эндогенной интоксикации (табл. 4). Установлено, что при измерении ОП предлагаемым методом УФ-поглощение проб возрастает в среднем на 20 по сравнению со способом-прототипом как для здоровых доноров, так и для больных. Относительное увеличение содержания ОП, или уровень токсемии, совпадал при измерении обоими методами. Собственное поглощение ОП при этом возрастает на 30 по сравнению с известным методом за счет снижения вклада непептидных компонентов в суммарное поглощение (табл. 2). 8050 1 2006.04.30 Таблица 4 Показатели оптического поглощения плазмы крови доноров и больных с эндогенной интоксикацией при измерении известным методом (280 нм, рН 6,5) и предлагаемым методом (290 нм, рН 13,0) Обследованная группа Доноры (5) Больные (5) Повышение показателя поглощения по отношению к норме,3. Повышение точности измерения ОП. Точность измерения суммарного содержания ароматических аминокислот характеризовали по отношению удельного поглощения триптофана и тирозина. В известном способе отношение удельного поглощения Трп/Тир 5,28, то есть практически регистрируется только поглощение триптофанилов в пептидах. В предлагаемом способе показатель Трп/Тир 2,19 и снижается в 2,4 раза, что существенно увеличивает точность измерения суммарного содержания ароматических аминокислотных остатков в пептидах. Разработанный способ может быть использован в медицинской диагностике для оценки выраженности токсемии у больных с синдромом эндогенной интоксикации. Перечень фигур чертежей Рисунок. Спектры поглощения супернатанта плазмы крови, полученного после осаждения белков 0,6 М хлорной кислотой, при разных рН (1- рН 7,4 2 - рН 11,0 3 - рН 13,0). Источники информации 1. Осипович В.К., Туликова З.А., Маркелов И.М. // Лаб. дело. - 1987. -3. - С.221-224(прототип 1). 2. Медицинские лабораторные технологии / Под. ред. А.И.Карпищенко. Т.2. - СПб Интермедика, 1999. 3. Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Кулаков Г.П. // Клин. Медицина. - 1981.10. С.38-42. 4. Николайчик В.В., Моин В.М., Кирковский В.В. и др. // Лаб. дело. - 1991. -10. С.13-18 (прототип 2). 5. Лабораторные методы исследования в клинике // Под ред. В.В. Меньшикова. М. Медицина, 1987. 6. Шарабчиев Ю.Т., Дубина Т.В. Показатели здоровья в цифрах и фактах. - Минск УП Юпоком, 2001. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.