Инактивированная вакцина против пастереллеза пушных зверей и способ ее получения

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Андрусевич Андрей Сергеевич Бирман Борис Яковлевич Полоз Светлана Васильевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(57) 1. Инактивированная вакцина против пастереллеза пушных зверей, содержащая штаммы-антигены, инактивант и адъювант, отличающаяся тем, что содержит в качестве штаммов-антигеновштамм сероварианта А КМИЭВ-67 и штамм сероварианта В КМИЭВ-68 в количестве по (5-6)109 кл/см 3, взятые в соотношении 11, в качестве инактиванта 36 -ный формальдегид, взятый в количестве 0,5 об.и в качестве адъюванта 10 -ную суспензию алюмокалиевых квасцов, взятую в количестве 10 об. . 2. Способ получения инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей по п. 1, заключающийся в том, что культивируют в отдельных реакторах штаммысероварианта А КМИЭВ-67 и сероварианта В КМИЭВ-68 на мясопептонном бульоне или на бульоне Хоттингера при температуре 37-38 С в течение 1214 часов при непрерывном перемешивании со скоростью 35-40 об/мин, аэрации и поддержаниив пределах 7,2-7,4, культуры разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации (5-6)109 кл/см 3, смешивают в соотношении 11, инактивируют в течение 5-7 суток при температуре 37-42 С 36 -ным формальдегидом, взятым в количестве 0,5 об. , добавляют 10 -ную суспензию алюмокалиевых квасцов в количестве 10 об.и доводятдо 7,2-7,4. Изобретение относится к области получения биопрепаратов и может быть использовано в биологической промышленности и ветеринарии для массовой профилактики пастереллеза пушных зверей. Известна инактивированная эмульгированная вакцина против пастереллеза животных и птиц, содержащая в своем составе серотипы 3, 4, 1 штамма 1. Эта вакцина обладает недостатком, характеризующимся тем, что в состав вакцины входят штаммысеротипы 3, 4, 1, которые обладают сравнительно 13773 1 2010.12.30 низкой иммуногенностью и содержат в качестве адъюванта эмульсиген, который обладает высокой реактогенностью при введении пушным зверям. Известна эмульсионная противопастереллезная вакцина, включающая штаммысеротипы А, Д и В, инактивант - аминоэтилэтиленимин и масленый адъювант 2. Недостатком данной вакцины является применение в качестве инактиванта аминоэтилэтиленимина и масленого адъюванта, что не подходит для пушных зверей, так как данные компоненты обусловливают реактогенность вакцины, применение которой отрицательно сказывается на качестве пушнины. Известные способы получения вакцин против пастереллеза не позволяют получить заявляемую вакцину ввиду того, что в состав известных вакцин входят штаммы, выделенные от других видов животных с низкой иммуногенной активностью для пушных зверей,а также для их получения применяют дорогостоящие компоненты - масленый адъювант и инактивант - аминоэтилэтиленимин. Известен способ получения инактивированной эмульгированной вакцины против пастереллеза животных и птиц, включающий получение суспензии культур пастерелл, инактивацию полученной культуры и смешивание штамма-антигена с масленым адъювантом 3. Недостатком данного способа является трудоемкость и относительная дороговизна компонентов. Известен способ получения эмульгированной противопастереллезной вакцины, включающей получение суспензии культур пастерелл, инактивацию полученной культуры и смешивание штамма-антигена с адъювантом 4. Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что он является относительно трудоемким и длительным, связанным с приготовлением масленого адъюванта. Задачей предлагаемого изобретения является конструирование высокоиммуногенной,ареактогенной и сравнительно дешевой вакцины для профилактики пастереллеза пушных зверей и разработка способа ее получения с использованием компонентов отечественного производства. Поставленная задача достигается тем, что инактивированная вакцина против пастереллеза пушных зверей, содержащая штаммы-антигены, инактивант и адъювант, содержит в качестве штаммов-антигеновштамм сероварианта А КМИЭВ-67 и штамм сероварианта В КМИЭВ-68 в количестве по (5-6)10 кл/см 3,взятые в соотношении 11, в качестве инактиванта 36 -ный формальдегид, взятый в количестве 0,5 об.и в качестве адъюванта 10 -ную суспензию алюмокалиевых квасцов,взятую в количестве 10 об. . Кроме того, поставленная задача достигается тем, что способ получения инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей, заключается в том, что культивируют в отдельных реакторах штаммысероварианта А КМИЭВ-67 и сероварианта В КМИЭВ-68 на мясо-пептонном бульоне или на бульоне Хоттингера при температуре 37-38 С в течение 12-14 часов при непрерывном перемешивании со скоростью 35-40 об/мин, аэрации и поддержаниив пределах 7,2-7,4, культуры разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации (5-6)109 кл/см 3, смешивают в соотношении 11, инактивируют в течение 5-7 суток при температуре 37-4236 -ным формальдегидом, взятым в количестве 0,5 об. , добавляют 10 -ную суспензию алюмокалиевых квасцов в количестве 10 об.и доводятдо 7,2-7,4. Штаммсеровариант А (КМИЭВ-67) - штамм-антиген выделен в звероводческих хозяйствах Республики Беларусь от пушных зверей, больных пастереллезом, является специфичным для пушных зверей и содержит активные и адекватные антигены для получения вакцины, обладающей высокой иммуногенностью. 13773 1 2010.12.30 Штамм депонирован и хранится в музее культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. Культурально-морфологические признаки штаммасеровариант А(КМИЭВ-67) - штамма-антигена. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, данный микроорганизм при окрашивании по Граму располагается в виде мелких грамотрицательных кокко-овоидов размером 0,28-1,450,15-0,2 мкм, располагающихся отдельно, иногда парами, может в виде цепочек. Имеется выраженное капсулообразование, спор не образует, неподвижен. В начале роста вызывает легкое помутнение бульона,иногда с образованием пристеночного кольца. На 4-5 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок при встряхивании пробирки, поднимающийся в виде косички, при этом наблюдается просветление бульона. На сывороточном агаре данный микроорганизм образует колонии с ровными краями, серовато-белого цвета диаметром 23 мм. На МПА растет в виде нежных мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в косопроходящем свете. Биохимические свойства. Штаммсеровариант А (КМИЭВ-67) штамм-антиген по биохимическим свойствам обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, манит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра - отрицательная, на индол - положительная. Не продуцирует гемолизин и уреазу. Антигенный состав. Имеет в своем составе - и -антигены. Другие особенности и маркерные признаки. Штаммсеровариант А (КМИЭВ-67) - штаммантиген в процессе роста образует гиалуроновую кислоту, которая может расщепляться гиалуронидазой, продуцируемой стафилококком. При взаимодействии с раствором акрифлавина в разведении 11000 штамм образует хлопьевидный осадок, разбивающийся при встряхивании. Антигенные свойства. Антигенная активность штаммасероварианта А (КМИЭВ-67) - штамма-антигена в РНГА составляет 8 2. Иммуногенность. Штаммасероварианта А (КМИЭВ-67) - штамма-антигена составляет 90 . Вирулентность. Штаммсеровариант А (КМИЭВ-67) - штаммантиген обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 0,3109 м.к. Чувствительность к антибиотикам. Штаммсеровариант А(КМИЭВ-67) - штамм-антиген чувствителен к следующим антибактериальным препаратам цефатоксиму, норфлоксацину, канамицину, цефалексину, пенициллину, энроксилу,гентамицину, амоксициллину, карбенициллину, рифампицину, доксициклину 5. Штаммсеровариант В (КМИЭВ-68) - штамм-антиген выделен в звероводческих хозяйствах Республики Беларусь от пушных зверей, больных пастереллезом, является специфичным для пушных зверей и содержит активные и адекватные антигены для получения вакцины, обладающей высокой иммуногенностью. Штамм депонирован и хранится в музее культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. Культурально-морфологические признаки штаммасеровариант В (КМИЭВ-68) - штамма-антигена. При микроскопии мазков, приготовленных из бульонных и агаровых культур, окрашенных по Граму, данный микроорганизм имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов размером 0,23-1,20,14-0,2 мкм, имеющих изолированное, парное расположение, иногда цепочное. Культура пастерелл спор не образует, неподвижна, имеет капсулу. На бульоне рост определяется в виде равномерного помутнения с образованием пристеночного кольца. На сывороточном МПА образует серовато-белые колонии с ровными краями, диаметром 1-2 мм. На агаровых средах пастереллы имеют вид нежных, мелких росинчатых колоний, дающих радужное свечение в косопроходящем свете. 3 13773 1 2010.12.30 Биохимические свойства. Штаммсеровариант В (КМИЭВ-68) штамм-антиген обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу,ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не обладает гемолитическими свойствами. Антигенный состав. Имеет в своем составе - и -антигены. Другие особенности и маркерные свойства. Штаммсеровариант В (КМИЭВ-68) - штаммантиген образовывает слабый хлопьевидный флоккулят при взаимодействии с раствором акрифлавина в разведении 11000. При встряхивании он разбивается. Антигенные свойства. Антигенная активность штаммасероварианта В (КМИЭВ-68) - штамма-антигена в Г составляет 9 о 2. Иммуногенность. Штаммасероварианта В (КМИЭВ-68) - штамма-антигена составляет 95 . Вирулентность. Штаммсеровариант В (КМИЭВ-68) - штаммантиген обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 0,23109 м.к. Устойчивость к антибиотикам. Штаммсеровариант В (КМИЭВ-68)- штамм-антиген чувствителен к следующим антибактериальным препаратам норфлоксацину, цефатоксиму, энроксилу, цефалексину, рифампицину, амоксициллину 6. Пример 1 Способ получения инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей осуществляется следующим образом. Для приготовления инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей используют 2 ампулы с сухой культурой производственных штаммовсеровариантов А и В. В каждую ампулу вносят 2-3 см МПБ растворяют и засевают во флаконы с мясопептонным бульоном (МПБ) и культивируют в течение 18 часов при температуре от 37 до 38 С. Затем культуру высевают на чашки Петри с 2 -ным МПА для отбора колоний только вформе, с которыми в дальнейшем ведут работу по изучению культуральных, морфологических, биохимических, вирулентных свойств штаммов. Для получения посевного материала 1-й генерации культуры пастерелл в объеме 0,5 см 3 засевают в 100 см 3 флаконы с МПБ или бульоном Хоттингера. Одновременно проводят контрольный засев в пробирки с МПБ и МПА. Культуры культивируют при температуре от 37 до 38 С в течение 10-12 часов. Выросшие культуры проверяют на морфологические свойства путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму, и культуральные свойства. Для получения посевного материала 2-й генерации культуры пастерелл из флаконов в количестве 20-25 см 3 засевают в 10-20 литровые бутыли, содержащие 5-6 литров стерильного бульона Хоттингера. Культуры выращивают в течение 14-18 часов при температуре от 37 до 38 С. Выросшие культуры пастерелл проверяют на морфологические свойства путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму и культуральные свойства. Для получения производственной расплодки подготовленные стерильные реакторы заполняют питательной средой (бульон Хоттингера) на 1/3 от их объема. Для предупреждения пенообразования к среде добавляют до 0,04 (40 см 3 на 0,1 м 3 среды) подсолнечного масла. Бульон в реакторах стерилизуют при температуре 120 С в течение 45 минут,охлаждают до 37-38 С и делают контрольный высев бульона на стерильность (МПА,МПБ, МППБ, среду Сабуро). Как стимулятор роста добавляют 0,4-0,6 дрожжевого экстракта. Проверенную культуру (посевной материал 2-й генерации) засевают в отдельные реакторы для культивирования в количестве 8-10 к объему среды. Культуры выращивают в течение 12-14 часов при температуре от 37 до 38 С при непрерывном перемешивании в пределах 35-40 об./мин. Подачу стерильного воздуха регулируют в зависимости от объема суспензии и продолжительности выращивания клеток. Режим аэрации приведен в таблице 1. 4 Режим аэрации в культиваторе Расход воздуха (л/ч) при объеме заполнений 10 л 15 л 0 0 15 25 В процессе роста через каждые два часа отбирают пробы для определения , концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Для улучшения условий роста пастерелл и снижения , при его повышении от 7,6 и выше, проводят дробную подачу стерильного 40 -ного раствора глюкозы до 2 -ного содержания сухой глюкозы в среде. В процессе ростаподдерживают в пределах 7,2-7,4. Выросшие культуры штаммовсеровариантов А и В смешивают в соотношении 11. Инактивация культуры. Выращенную в реакторах чистую культуру пастерелл скачивают в подготовленный стерильный реактор и при необходимости разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации (5-6)109 кл/см 3. При включенной мешалке реактора добавляют 36 формальдегид, взятый в количестве 0,5 об. . Инактивацию культур проводят в течение 5-7 суток при температуре от 37 до 42 С. По окончании инактивации к культуре добавляют 10 -ную суспензию алюмокалиевых квасцов в количестве 10 об. . Вакцину подщелачивают 4 -ным раствором гидроокиси натрия до 7,2-7,4. Пример 2 Бактериологический контроль стерильности полученной вакцины осуществляют следующим образом. Пробы вакцины высевают в объеме 0,2 см 3 в пробирки с МПБ, МПА,средами Сабуро и Китта-Тароцци и по 2 см 3 во флаконы с МПБ и средой Китта-Тароцци по 3 пробирки и 3 флакона с каждой средой. Через двое суток из жидких питательных сред проводят пересев на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Посевы на среде Сабуро выдерживают в термостате при температуре от 20 до 22 С, а на остальных средах - при температуре от 37 до 38 С в течение 10 суток первичные посевы, в течение 8 суток - вторичные. Одновременно проводят контроль стерильности питательных сред. Результаты первичного и вторичного посевов оценивают путем микроскопического исследования посевов. Рост микроорганизмов на питательных средах отсутствует. Пример 3 Контроль безвредности и реактогенности полученной вакцины осуществляют следующим образом. Безвредность вакцины определяли путем подкожного введения в область спины препарата 10-ти белым мышам массой 18-20 г в дозе 1 см 3. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Все животные остались живы. Реактогенность инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей устанавливали путем внутримышечного введения 5-ти клинически здоровым кроликам и норкам в дозе по 5 см 3 с внутренней стороны бедра. Наблюдения вели в течение 10 дней. В течение всего срока наблюдения местной и общей реакции организма на введение препарата не установлено. Через 10 дней после введения вакцины провели убой кроликов и норок, при осмотре места введения наличие остатков вакцины не обнаружено. Пример 4 Определение иммуногенной активности полученной вакцины осуществляют следующим образом. Испытания вакцины на иммуногенные свойства провели на 50 белых мышах путем двукратной иммунизации с интервалом 7 дней с их последующим заражением. 5 13773 1 2010.12.30 Из животных сформировали 5 групп (2 опытные и 3 контрольные) по 10 животных в каждой группе. Мышей опытных групп иммунизировали подкожно в области спины в объеме 0,3 см 3 инактивированной вакциной. Напряженность иммунитета определяли через 14 дней после повторной вакцинации путем подкожного заражения животных опытных и контрольных групп объемом 0,5 см 3 18 - часовой бульонной культурой в дозе 250 каждого штамма в раздельности (животных 1 опытной группы и 1 контрольной - серовариантом, животных 2 опытной и 2 контрольной групп - серовариантом В, контрольной группе 3 вводили физиологический раствор по той же схеме. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Результаты исследований показали, что в опытных группах 1 и 2 пало по одной мыши. В контрольных группах 1 и 2 отмечали гибель 100 животных, в контрольной группе 3 - все мыши остались живы. Таблица 2 Иммуногенная активность инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей Группы животных Количество павших животных Количество выживших животных 1 опытная 1 9 2 опытная 1 9 1 контрольная 10 2 контрольная 10 3 контрольная 10 Иммуногенная активность инактивированной вакцины против пастереллеза пушных зверей составила длясероварианта А - 90 , исероварианта В - 90 . Таким образом, заявленное изобретение позволяет сконструировать высокоиммуногенную, ареактогенную, предназначенную для пушных зверей, и простую в применении вакцину за счет того, что в вакцине и способе ее получения используются высокоиммуногенные, специфичные и адекватные в антигеном отношении штаммысеровариант А (КМИЭВ-67) - штамм-антиген исеровариант В (КМИЭВ-68) - штамм-антиген, подобранные в оптимальных соотношениях 11 в качестве инактиванта 36 формальдегид, обеспечивающий необходимую полноту инактивации по сравнению с аминоэтилэтиленимином в прототипе, алюмокалиевые квасцы в качестве адъюванта, обеспечивающие равномерное поступление антигена и обладающие минимальной реактогенностью по сравнению с масленым адъювантом (эмульсиген) в прототипе. Предложенная инактивированная вакцина против пастереллеза пушных зверей обладает высокой специфичностью, ареактогенностью и иммуногенность ее составляет 90 . Способ ее получения основан на использовании компонентов отечественного производства, достаточно проста в производстве, что делает ее гораздо дешевле, чем в прототипе. Источники информации 1. Лизун Р.П. Иммунопрофилактика пастереллеза птиц в Республике Беларусь Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Р.П. Лизун. - Минск,2002. - С. 8-9. 2. Патент 2162339, МПК 761 39/102,61 2/16,12 1/00. Опубл. 27.01.2001 // Бюл.3 (прототип). 3. Лизун Р.П. Иммунопрофилактика пастереллеза птиц в Республике Беларусь. Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Р.П. Лизун. - Минск,2002. - С. 9. 6 13773 1 2010.12.30 4. Патент 2162339, МПК 761 39/102,61 2/16,12 1/00. Опубл. 27.01.2001 // Бюл.3 (прототип). 5. Андрусевич А.С. Определение вирулентности различных серовариантов, выделенных от пушных зверей на лабораторных животных / А.С. Андрусевич // Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства Материалы 6 междунар. науч.-практ. конф., Витебск, 2007 г. / УО ВГАВМ. - Витебск, 2007. - С. 16-17. 6. Андрусевич А.С. Определение вирулентности различных серовариантов, выделенных от пушных зверей на лабораторных животных / А.С. Андрусевич // Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства Материалы 6 междунар. науч.-практ. конф., Витебск, 2007 г. / УО ВГАВМ. - Витебск, 2007. - С. 16-17. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.