Способ оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСТРОЙ ВОДНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ИЛИ ВЕЩЕСТВ ОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Дроздова Елена Валентиновна Вежновец Василий Васильевич Застенская Ирина Алексеевна Филонов Валерий Петрович Дудчик Наталья Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(56)С 2,92/69/,/////20 20 Дроздова Е.В. и др. // Природные ресурсы. - 2008. -1. - С. 53-58. Дроздова Е.В. Здоровье и окружающая среда Сборник научных трудов. 2007. - Вып. 10. - С. 728-737. Дроздова Е.В. и др. Здоровье и окружающая среда Сборник научных трудов. - 2008. - Вып. 12. - С. 271-277. ФР.1.39.2007.03222 Биологические методы контроля. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. - С. 2, 26-28,// ФР.1.39.2007.03221 Биологические методы контроля. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодафний. - . 2, 26-30,//2029948 1, 1995.2152613 1, 2000.(57) Способ оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы путем экспонирования ракообразных водными растворами тестируемого 16203 1 2012.08.30 вещества в разных концентрациях при температуре 18-22 С, учета эффекта в виде иммобилизации и последующего расчета медианной эффективной концентрации ЭК 50, отличающийся тем, что в качестве ракообразных используют молодь, размером не более 0,3 мм, культуры ракообразных, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678,0 (70,985,8) мг/дм 3,ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3, экспонирование тестируемым веществом проводят в течение 96 часов, при получении значения ЭК 501 мг/дм 3 тестируемое вещество относят к категории острая 1, при 1 ЭК 5010 мг/дм 3 - к категории острая 2,а при 10 ЭК 50100 мг/дм 3 - к категории острая 3. Изобретение относится к разделу водной токсикологии. Известен способ оценки острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы путем экспонированияводными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 48 часов и последующим расчетом медианной эффективной концентрации (ЭК 50) 1. В качестве эффекта расценивается иммобилизация животных - отсутствие их способности к движению в течение 15 секунд после слабого перемешивания раствора тестируемого вещества. Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что оценка острой водной токсичности осуществляется по иммобилизации животных при экспонировании тест-объектов растворами тестируемого вещества в разных концентрациях и последующему расчету ЭК 50. Однако способ-прототип не обладает универсальной чувствительностью ко всем группам химических веществ, в том числе к тяжелым металлам и веществам органической природы. Задачей заявленного изобретения является повышение чувствительности способа оценки острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы путем экспонирования ракообразных водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях при температуре 18-22 С, учета эффекта в виде иммобилизации и последующего расчета медианной эффективной концентрации ЭК 50,при этом в качестве ракообразных используют молодь, размером не более 0,3 мм, культуры ракообразных, обладающей чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3,ЭК 84-96230 мг/дм 3, экспонирование тестируемым веществом проводят в течение 96 часов, при получении значения ЭК 501 мг/дм 3 тестируемое вещество относят к категории острая 1, при 1 ЭК 5010 мг/дм 3 - к категории острая 2, а при 10 ЭК 50100 мг/дм 3 - к категории острая 3.- это типичный представитель низших ракообразных отрядасемейства . Как тест-объектобладает рядом положительных характеристик 1. Образует стабильные популяции в любое время года, в то время как у(к которым относится) может наблюдаться нарушение партеногенетического размножения при изменении условий культивирования, особенно в зимний период времени. 2. Широко представлен в окружающей среде, обитая как в постоянных, так и временных водоемах, а также и подземных водах. Культура, обладающая чувствительностью к референсному веществу дихромату калия на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, хранится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены под кодом ЦГ-2 (220012 Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 8, тел. 284 13 86, факс 284 03 45) и может 2 16203 1 2012.08.30 быть получена (закуплена) по запросу либо получена заинтересованным лицом из дикой природы путем полного следования этапам, описанным ниже. На фиг. 1 показана схема получения тест-культуры, обладающей чувствительность к эталонному агенту дихромату калия в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Исходная лабораторная культура(культура 2 на схеме) была получена из животных, выделенных из природных условий - водных экосистем Минской области, Республика Беларусь (культура 1 на схеме - природная (дикая) культура). В лабораторных условиях была получена исходная культура,представляющая собой потомство одной самки - генетически однородна (культура 2 на схеме), в дальнейшем последующие серии культур (на схеме 31,32,33 3 - лабораторная культура .соответственно серий 1, 2, 3 ), полученные из исходной,использовались как тест-объекты для проведения оценки острой водной токсичности (на схеме обозначено как- эксперименты с референсным агентом дихроматом калия). Последующий отбор проводился с учетом чувствительности к эталонному токсиканту (дихромат калия) и скорости роста культуры в лабораторных условиях (на схеме обозначено как ). В итоге была получена лабораторная генетически однородная культура ракообразных, зарегистрированная как ЦГ-2 (на схеме обозначена как 4), обладающая чувствительностью к эталонному агенту дихромату калия в следующем диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3 (содержится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены). Поддержание культуры осуществляется при световом режиме 12 ч день 12 ч ночь и температуре от 18 до 24 С, для кормления используется альгологически чистая культура водорослейс плотностью суспензии не менее 100106 клеток/мл, вносимая ежедневно и поддерживаемая в концентрации 105 клеток/мл. Эти условия являются оптимальными, способствуют поддержанию жизнедеятельности и воспроизводству особей, а также поддержанию постоянной чувствительности тест-культуры к эталонному агенту. Основными определительными фенотипическими признаками, используемыми в заявленном способе, являются следующие тело животных заключено в двустворчатую раковину длиной до 0,7 мм с латерально расположенными створками и снабжено 7 парами конечностей. При рассматривании сбоку наибольшая высота раковинки достигает 2/3 ее длины и расположена посередине. Спинной край в средней части довольно сильно выпуклый, брюшной край слабо вогнут в средней части и образует выпуклость у ротового отверстия. Передний край равномерно и широко закруглен, задний уже переднего и косо закруглен. Со спинной стороны раковинка широко-яйцевидная наибольшая ширина приблизительно в середине раковинки и несколько превышает ее высоту задний конец закруглен, передний широко заострен левая створка превосходит спереди правую приблизительно на ширину своей кутикулярной каемки поверхность створок сильно волосиста, с маленькими ямочками на основном фоне желтовато-зеленоватых створок резко выступают 3 пары лентовидных темных пятен неправильных очертаний, которые идут от спинной стороны сначала поперек створок, а затем переднее пятно простирается вдоль передних краев створок, а два других пятна связываются на спинной стороне таким же пятном, идущим вдоль спинного края. Отличительная характеристика данной культуры - чувствительность к эталонному агенту дихромату калия в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Проведенные заявителем исследования показали более высокую чувствительность предложенного способа оценки острой водной токсичности, основанного на использовании культуры ракообразных, по отношению к тяжелым металлам и веществам органической природы (одноатомным спиртам, пестицидам) и другим соединениям по сравнению с известным способом оценки острой водной токсичности, основанным на использовании. 3 16203 1 2012.08.30 Время воздействия 96 часов в предложенном способе обусловлено тем, что в течение этого периода времени максимально проявляются острые токсические эффекты химических веществ по отношению к. Температурные параметры 18-22 С позволяют обеспечить оптимальные жизненные условия дляв течение периода тестирования. Общая схема проведения тестирования острой водной токсичности с использованием культурывключает 2 основные стандартные процедуры- подготовка к тестированию и- непосредственно тестирование.- Подготовка к тестированию. Этапы 1) сбор имеющейся доступной информации о химическом веществе (растворимость в воде, давление насыщенного пара, химическая устойчивость, константы диссоциации, биоразлагаемость, структурная формула, степень чистоты, происхождение, процентное содержание значимых примесей, присутствие добавок и их количество, коэффициент распределения -октанол/вода) и ее анализ 2) разработка схемы исследований выбирают тест-систему в зависимости от стойкости вещества (статическую, проточную или полустатическую), вспомогательные вещества для тестирования веществ с низкой водорастворимостью (из органических растворителей рекомендуются триэтиленгликоль, диметилформамид, этанол, ацетон) 3) культивирование или закупка тест-культуры 4) адаптация культуры к тестовым условиям (температура, вода того же состава, что и используемая в тесте в качестве растворителя) в течение не менее 48 часов. Для исключения необходимости периода акклиматизации, культивационная вода должна иметь сходный состав (, жесткость) с водой, используемой для теста 5) отбор организмов для проведения тестирования.культивируют в лабораторных условиях со световым режимом 12 ч день 12 ч ночь. Для культивирования используется стеклянная посуда, для ежедневного кормления - культура водорослей . За сутки до начала тестирования отбираются подвижные юные особи, из которых в день проведения опыта отбирают животных размером не более 0,3 мм 6) тест с эталонным веществом (не реже 1 раза в 6 месяцев) проводят для подтверждения того, что чувствительность тест-культуры значительно не изменилась с течением времени. В качестве эталонного вещества предлагается использовать дихромат калия, чувствительность к дихромату калия должна находиться в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Чувствительность к эталонному (референсному) токсиканту является одной из важнейших метрологических характеристик в биотестировании, позволяющих оценить сходимость и воспроизводимость полученных результатов. Тест-объекты должны реагировать на воздействие эталонного агента в оговоренном методикой диапазоне. Если чувствительность лабораторной тест-культуры не удовлетворяет установленным требованиям, анализируют возможные причины снижения чувствительности, проводят соответствующую корректировку условий их культивирования либо выращивают культуру из новых исходных маточных популяций 7) приготовление растворов тестируемых веществ заданных концентраций. Исходные растворы требуемого состава готовят путем растворения исследуемого вещества в воде. В качестве воды для приготовления растворов используют воду из поверхностных или подземных источников, восстановленную либо дехлорированную водопроводную воду. Выбранные тестовые концентрации готовят разведением маточного (исходного) раствора вещества. Если тестируют высокие концентрации, вещество может быть растворено в воде непосредственно. Если используют вспомогательное вещество, все тестируемые растворы должны содержать его в равных количествах. Обязательно введение дополнительного контроля, содержащего кроме воды эквивалентное используемому в сериях разведений количество вспомогательного вещества. 4 16203 1 2012.08.30- Тестирование. Тестирование проводят в 2 или 3 (если необходимо) этапа 1) тест на установление границ исследования. Ракообразных в течение 96 часов экспонируют концентрациями в широком диапазоне - не менее 5 особей на каждое разведение с целью установления диапазона концентраций для окончательного тестирования 2) окончательный тест, его цель - построить кривую концентрация - ответ на основании полученных данных и установить значения 24-ч, 48-ч и 96-ч ЭК 50. Не менее 20 животных должны экспонироваться пятью и более концентрациями, выбранными в геометрической прогрессии с отношением между ними от 1,5 до 2. Каждый вариант опыта ставят не менее чем в 3-х повторностях 3) контрольный тест - животных экспонируют веществом в концентрации 100 мг/л в течение 96 часов. Проводят в случае, если полученное значение ЭК 50 более 100 мг/л. Техника проведения эксперимента. В ходе эксперимента молодь из культуры ракообразныхразмером не более 0,3 мм экспонируют растворенным в воде веществом в диапазоне концентрации в течение 96 часов. Животные, экспонируемые каждой концентрацией, должны быть разделены на 2-4 группы с равным количеством особей в каждой. Растворы тестовых концентраций готовят непосредственно перед внесением тесторганизмов. Эксперимент начинают не позднее чем через 30 минут с момента приготовления растворов. Контроль концентрации проводят в начале и конце теста. Контроль. В дополнение к серии разведений тестируемого вещества, ставят контроль чистоты эксперимента (исходная вода для приготовления разведений без вещества). Если в ходе эксперимента применяют вспомогательные вещества, необходим дополнительный контроль. Посуда для проведения опытов должна быть сделана из химически инертных материалов (предпочтительно из стекла). Манипуляции с ракообразными проводят с использованием стандартной микробиологической посуды стаканы, пипетки. Кормление. В течение теста животных не кормят. Параметры микроклимата. Тест проводят с чередованием циклов света и темноты 16 ч 8 ч либо 12 ч 12 ч соответственно с 15-30-минутным переходным периодом. Температура должна быть в пределах 18 и 22 С, но для каждого отдельного теста должна быть постоянной в пределах 1 С.в контроле и тестовых растворах измеряют в начале теста, через 24 и 96 часов. Учет результатов тестирования. Проводится через 24, 48 и 96 часов. В качестве тест-реакции на воздействие токсиканта рассматривают изменение подвижности животных (иммобилизацию). Признаком иммобилизации ракообразных является отсутствие у животных способности к движению в течение 15 секунд после легкого встряхивания тестируемого субстрата 3-7 установление иммобилизации проводится визуально в проходящем свете либо в световом микроскопе при малом увеличении. Регистрация иммобилизации в качестве тест-реакции проста, не требует специального оборудования и персонала высокой квалификации. При проведении тестирования должны соблюдаться следующие критерии 1) в течение теста концентрация вещества должна поддерживаться в пределах 80 от исходной. Для веществ, легко растворимых в контрольной среде, за исходную может быть принята эквивалентная номинальная концентрация. Для плохо растворимых в контрольной среде веществ за исходную принимают концентрацию, измеренную непосредственно в растворе в начале теста. Концентрацию определяют после установления равновесия до внесения тест-организмов 2) значениедолжно варьировать не более чем на 1 единицу 3) иммобилизация в контролях не должна превышать 10 . Обработка и интерпретация полученных данных. 5 16203 1 2012.08.30 Для количественной оценки токсичности веществ в предложенном способе оценки острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы используют значения эффективных концентраций - ЭК (в англоязычном варианте -(, в частности ЭК 50 - медианных эффективных концентраций. Медианная эффективная концентрация (ЭК 50) - экспериментально полученное значение концентрации химического вещества (смеси) в воде, вызывающей изменение тестреакции (в данном случае это потеря способности двигаться тест-объектами - иммобилизация) у 50 особей тестируемой популяции при краткосрочном воздействии в течение заданного срока наблюдений 5. Концентрации, вызывающие 0 и 100 иммобилизации, выводят непосредственно из результатов эксперимента, ЭК 50 - за 24, 48 или 96 ч методом расчета. Обработку данных проводят с использованием программыметодом пробитанализа. Рассчитывают значение ЭК 50 для каждого периода наблюдения (24, 48, 96 ч). Интерпретацию данных производят на основании полученных значений ЭК 50. Отнесение вещества к категории острой опасности для водной среды осуществляется в соответствии с критериями, приведенными в согласованной на глобальном уровне системе классификации и маркировки химических веществ 2, а именно при ЭК 501 мг/дм 3 - к категории острая 1,при 1 ЭК 5010 мг/дм 3 - к категории острая 2,при 10 ЭК 50100 мг/дм 3 - к категории острая 3. Согласно требованиям согласованной на глобальном уровне классификации и маркировки химических веществ и их смесей 2 Испытания острой токсичности, проводимые на ракообразных, начинают с личиночных стадий. В случае дафний испытание длится 48 часов. Для остальных ракообразных, таких как мизидии и другие, продолжительность испытания составляет обычно 96 часов 2 пункт 8.3.2.6.1. Таким образом,оговоренная предложенным способом длительность экспозиции культуры ракообразныхтестируемым веществом (96 часов) позволяет получить информацию об острой токсичности вещества. Пример требуется определить острую водную токсичность нитрата кадмия. В качестве тест-объекта использовали культуру ракообразныхЦГ-2 из рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены. Подготовку культуры к исследованию и тестирование проводили в соответствии с методикой,приведенной выше. С целью установления диапазона концентраций для окончательного тестирования ракообразных в течение 96 часов экспонировали концентрациями 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1 и 0,1 мг/дм 3 ставили 2 контроля. Количество особей, экспонированных раствором вещества в каждом разведении и контроле, - 8 особей. Полученные результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Концентрация,мг/дм 3 100 75 50 25 10 5 1 0,1 Контроль 1 Контроль 2 Количество животных, у которых наблюдался эффект (иммобилизация) 8 8 8 8 8 8 8 8 0 0 16203 1 2012.08.30 На основании результатов 1-го этапа проводили окончательный тест с концентрациями 0,1 0,05 0,01 0,007 0,005 0,003 0,001 0,0007 0,0003 0,0001 0,00007 мг/дм 3 в 3-х повторностях по 10 особей в группе. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Концентрация,Количество Количество животных, у которых Эффект,мг/дм 3 животных наблюдался эффект (иммобилизация) 0,1 30 30 100 0,05 30 28 93,3 0,001 30 29 96,7 0,007 30 28 93,3 0,005 30 25 83,3 0,003 30 17 56,7 0,001 30 17 56,7 0,0007 30 19 63,3 0,0003 30 12 40,0 0,0001 30 6 20,0 0,00007 30 5 16,7 Контроль 1 10 0 0 Контроль 2 10 0 0 Контроль 3 10 0 0 На основании полученных результатов рассчитали ЭК 50-96 методом пробит-анализа с использованием программы , что графически представлено на фиг. 2. Для этого полученные результаты переводили в пробиты и строили в программеграфик на осьнаносили десятичные логарифмы концентраций, добавляли линию тренда и уравнение регрессии. С помощью уравнения регрессии нашли ЭК 50, ЭК 16 и ЭК 84 и далее обработали данные методом пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону. Значение ЭК 50 нитрата кадмия для культурысоставляет 0,0006(0,000360,00087) мг/дм 3, в то время как при проведении оценки токсичности по способупрототипу ЭК 50 составляет 0,01 (0,00690,0148) мг/дм 3. Это свидетельствует о большей чувствительности культурык действию нитрата кадмия по сравнению с. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в повышении чувствительности способа оценки острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы, в связи с чем способ может быть использован для токсикологической оценки новых потенциально опасных для водной среды химических веществ, внедряемых в хозяйственную деятельность, для контроля качества природных и сточных вод, установления нетоксичной степени разбавления стоков, в природоохранной деятельности. Может использоваться как индивидуально, так и в батарее тестов. Источники информации 1..2. //, 1992 прототип. 2.//. -, 2003. 3. Жмур Н.С. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв,осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний ФР. 1.39.2001.00283 / Н.С. Жмур. - М. АКВАРОС, 2001. - 48 с. 7 16203 1 2012.08.30 4. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. - М. РЭФИА, НИА-Природа,2002. - 118 с. 5..2/ Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8