Способ определения показателя токсичности LD50 химического вещества

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЯ ТОКСИЧНОСТИ 50 ХИМИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Соколов Сергей Михайлович Мельникова Людмила Александровна Котеленец Антонина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56) ДУДЧИК Н.В. и др. Проблемы общественного здоровья и здравоохранения Республики Беларусь Материалы Республиканской научно-практической конференции. - Минск, 2005. - С.330-332.1686376 А 1, 1991. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста Методические рекомендации. - Москва, 2000. - С. 13-16. Альтернативные методы исследований(экспресс-методы) для токсикологогигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. Москва, 1999. - С.34-35. ХОЛОДЕНКО В.П. и др. // Российский химический журнал. - 2001. - Т. .5-6. - С. 135-141.(57) Способ определения показателя токсичности 50 химического вещества, отличающийся тем, что регистрируют импедиметрически время детекциитест-штамма бактерийБИМ В-95 илиБКР В-264, который культивируют в питательной среде, не содержащей химическое вещество, и в среде, содержащей химическое вещество в нескольких концентрациях, при этом показатель токсичности 50 определяют как такую концентрацию химического вещества, которая увеличиваеттест-штамма в 1,5 раза по сравнению с егов отсутствие химического вещества. Изобретение относится к разделу токсикологии и санитарной микробиологии. Известен способ оценки токсичности химических веществ с использованием простейших , заключающийся в том, что осуществляют подсчет числа клеток под микроскопом в среде, не содержащей испытуемое химическое вещество, и в среде, содержащей испытуемое химическое вещество, и определяют показатель 50 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Однако способ-прототип обладает низкой чувствительностью, в связи с чем требуется длительное, до 96 часов, время проведения испытаний. Кроме того, тест-культураобладает разной чувствительностью к химическим веществам, при этом некоторые из веществ не оказывают влияния на тест-культуру. 14267 1 2011.04.30 Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение в разных концентрациях в питательную среду, содержащую ранее определенную концентрацию тест-культуры, химических веществ и их смесей и проводят их совместное культивирование с последующей обработкой полученных данных. Задачей заявленного изобретения является разработка способа оценки токсичности химических веществ и их смесей, позволяющего повысить чувствительность, сократить время тестирования и увеличить число тест-культур для оценки токсичности широкого круга химических веществ. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения показателя токсичности 50 химического вещества путем регистрации импедиметрически времени детекциитест-штамма бактерийБИМ В-95 илиБКР В-264, который культивируют в питательной среде, не содержащей химическое вещество, и в среде,содержащей химическое вещество в нескольких концентрациях, при этом показатель токсичности 50 определяют как такую концентрацию химического веществ, которая увеличиваеттест-штамма в 1,5 раза по сравнению с егов отсутствие химического вещества. Такой прием позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что осуществляется импедиметрическая регистрация электрохимических изменений питательной среды, а это позволяет провести детекцию роста тест-культуры в течение 2-10 часов, а также увеличить число тест-культур для анализа. Пример выполнения Требуется определить 50 для химических веществ 1 и 2. В качестве тест-культур используютБИМ В-95 иБКР В-264 из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов(научная коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси. В качестве питательной среды дляБИМ В-95 при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды) 1 Пептон 10,0 г 2 Дрожжевой экстракт 5,0 г 3 Глюкоза 10,0 г 45,0 г 7,2-7,4. Стерилизация 121 С в течение 20 мин. В качестве питательной среды дляБКР В-264 при проведении исследования используют овсяный агар. Для приготовления рабочих культур тест-штаммы культивируют на соответствующих питательных средах в термостате при (282) С в течение 48 ч. Содержание клеток тестштаммов в инокуляте доводят до 104 КОЕ/мл, что является оптимальным для исследования. Подтверждение содержания клеток в рабочей культуре проводят путем высева на питательные агаризованные среды. Приготовленные среды инокулируют тест-штаммамиБИМ В-95 иБКР В-264, разливают в ячейки анализатора, вносят исследуемые вещества в последовательно увеличивающихся концентрациях и инкубируют в термоинкубаторе при 28 С в течение 10-12 часов. Получены следующие результаты. Время детекции роста тест-культуры(без исследуемых веществ) составляет дляБИМ В-95 2,2 часа, дляБКР В-264 6,0 часа. 2 14267 1 2011.04.30 Для вещества 1 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляетБИМ В-95 БКР В-264 Концентрация 0,01- 2,2 часа Концентрация 0,01- 6,2 часа Концентрация 0,02- 2, 8 часа Концентрация 0,02- 7,8 часа Концентрация 0,03- 3,3 часа Концентрация 0,03- 9,0 часа Концентрация 0,04- 4,1 часа. Концентрация 0,04- 11,1 часа. Таким образом, при внесении в среду вещества 1 в концентрации 0,03 время детекции тест-культурыБИМ В-95 возросло с 2,2 часа до 3,3 часа, а тест-культурыБКР В-264 возросло с 6,0 до 9,0 часа, т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для вещества 1 составляет 0,03 . Для вещества 2 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции составляетБИМ В-95 БКР В-264 Концентрация 0,1- 2,2 часа Концентрация 0,1- 6,2 часа Концентрация 1- 2,2 часа Концентрация 1- 7,8 часа Концентрация 10- 2,2 часа Концентрация 10- 9,0 часа Таким образом, при внесении в среду вещества 2 в концентрации 0,1-10 время детекции тест-культурыБИМ В-95 не изменялось, т.к. данная тесткультура не чувствительна к тестируемому веществу. Время детекции тест-культурыБКР В-264 возросло с 6,0 до 9,0 часа для концентрации 10 , т.е. увеличилось на 50 . Поэтому 50 для вещества 2 составляет 10 . Кроме указанных тест-культур, в заявленном способе могут быть использованы в качестве тест-штаммов мицелиальные, дрожжеподобные грибы, бактерии, простейшие, обладающие чувствительностью к исследуемым веществам. Параллельно было проведено определение 50 для веществ 1 и 2 по способупрототипу. Получены следующие результаты для определения 50 вещества 1 потребовалось 96 часов, а показатель 50 вещества 2 не был определен, т.к. тест-культуране показала чувствительности к веществу 2. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в увеличении чувствительности, уменьшении времени тестирования с 96 часов до 2,2 -9,0 часов, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также увеличении числа тест-культур при проведении определения токсичности. Источники информации 1. ДУДЧИК Н.В. и др. Проблемы общественного здоровья и здравоохранения Республики Беларусь Материалы Республиканской научно-практической конференции. - Минск,2005. - С. 330-332. 2.1686376 А 1, 1991. 3. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста Методические рекомендации. Москва, 2000. - С. 13-16. 4. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. - Москва, 1999. - С. 34-35. 5. ХОЛОДЕНКО В.П. и др. // Российский химический журнал. - 2001. - . . -5-6. С. 135-141. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3