Тест-объект для оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ТЕСТ-ОБЪЕКТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОСТРОЙ ВОДНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ИЛИ ВЕЩЕСТВ ОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Дроздова Елена Валентиновна Вежновец Василий Васильевич Застенская Ирина Алексеевна Филонов Валерий Петрович Дудчик Наталья Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(56) Брагинский Л.П. Гидробиологический журнал.- 2000. - Т. 36. -5. - С. 50-70. ДРОЗДОВА Е.В. Здоровье и окружающая среда Сб. науч. трудов. - 2007. Вып. 10. - С. 728-737. ДРОЗДОВА Е.В. и др. Здоровье и окружающая среда Сб. науч. трудов,2008. Вып. 12. - С. 271-277. Реферативный сборник непубликуемых работ. Отчеты НИР, ОКР, ОТР. Минск, 2009. Вып. 2. - С. 31. ДРОЗДОВА Е.В. Сахаровские чтения 2007 года экологические проблемывека. Материалы 7-й Международной научной конференции. - Минск, 2007. С. 128. ДРОЗДОВА Е.В. и др. Применение биотестирования в оценке токсичности сточных вод, 2008, ////2008/10/846 ФР.1.39.2007.03222. Биологические методы контроля. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. - М. АКВАРОС, 2007. - С. 2, 810, 26-28 // ФР.1.39.2007.03221. Биологические методы контроля. Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости цериодафний. М. АКВАРОС, 2007. - С. 2-3, 7-9, 26-29(57) Применение культуры ракообразных, обладающей чувствительностью к дихромату калия на уровне ЭК 50-9678,0 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3,ЭК 84-96230 мг/дм 3, в качестве тест-объекта для оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы. 15770 1 2012.04.30 Изобретение относится к разделу экотоксикологии. Из уровня техники известно использование ракообразныхдля оценки острой водной токсичности веществ различной природы, в том числе тяжелых металлов и веществ органической природы 1, 2. Данный рачок считается классическим объектом, используемым в качестве аналитического индикатора еще с 30-х годов прошлого века, и является одним из наиболее чувствительных биотестов. Этот факт обусловлен тем,что эти животные являются фильтраторами и питаются органическими взвесями. Однако чувствительность дафний к различным веществам, особенно органическим, существенно зависит от свойств этих веществ. Так, для ряда веществ концентрации реагирования дафний находятся на уровне 1-10 гигиенических предельно допустимых концентраций (ПДК),например, для ПАВ это концентрации от 0,8 до 30 мг/дм 3 (1,6-60 ПДК), полихлорпинена 0,5 мг/дм 3 (2,5 ПДК), гептахлора и альдрина - 110-3-510-2 мг/дм 2 (1-25 ПДК), что свидетельствует о высокой чувствительности дафниий к этим веществам. При воздействии ряда веществ дафнии погибают в концентрациях значительно ниже (в 1,25-43,5 раз) ПДК этих веществ в воде - 0,023 ПДК гидрохинона, 0,08 ПДК резорцина, 0,2 ПДК триоктиламина,0,25 ПДК серебра, 0,2 ПДК ДДТ. В то же время дафнии не чувствительны к некоторым, в том числе и высокотоксичным и кумулятивным для человека, соединениям дихлорэтилену до 131000 ПДК, дихлорэтану - до 13500 ПДК, гептиловому спирту - до 18800 ПДК, таллию - 20000 ПДК. Таким образом, при использовании для биотестирования дафний, помимо общей для всех биотестов методологической проблемы - нечувствительности тестобъекта к токсичным для человека концентрациям многих химических соединений, возникает еще и другая - проблема гипердиагностики опасности загрязнения воды веществами, малотоксичными для человека, но высокотоксичными для дафний. К серьезным недостаткам дафний как объекта для токсикологических экспериментов также можно отнести сложность их разведения в зимний период, чувствительность к сезонным ритмам. Так, при резкой смене условий содержания, что часто встречается зимой,.переходит к половому размножению, что может сопровождаться изменением ее чувствительности к поллютантам. Кроме того, операции, связанные с поддержанием культуры, достаточно трудоемки. Вышеизложенное свидетельствует о том, чтоне обладает универсальной чувствительностью ко всем группам химических веществ, в том числе к тяжелым металлам и веществам органической природы. Задача настоящего изобретения - получение культуры ракообразных, как тест-объекта более чувствительной по сравнению ск химическим веществам, в частности к тяжелым металлам и веществам органической природы, и легче культивируемой в лабораторных условиях по сравнению со стандартными тест-объектами. Кроме того, данный вид ракообразных должен быть свойственен фауне Республики Беларусь. Поставленная задача достигается применением культуры ракообразных, обладающей чувствительностью к дихромату калия на уровне ЭК 50-9678(70,985,8) мг/дм 3 , ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3, в качестве тест-объекта для оценки острой водной токсичности тяжелых металлов или веществ органической природы. Основными достоинствами заявленного тест-объекта по сравнению с существующими стандартными являются следующие 1. В лабораторных условиях культура стабильна в любое время года, в то время как при резком изменении условий культивирования, особенно в зимний период времени, (к которым относятся наиболее широко распространенные стандартные тестобъектыи) переходят от партеногенетического размножения к половому 1, что не удовлетворяет требованиям к проведению эксперимента, так как меняется однородность популяции. 2. Видшироко представлен в окружающей среде Республики Беларусь, обитая в постоянных и временных водоемах, а также подземных водах, и является эвритопным и эврибионтным. 2 15770 1 2012.04.30 3. Культура ракообразных обладает большей чувствительностью к ряду химических соединений, в том числе к тяжелым металлам и веществам органической природы. Для достижения поставленной цели проведен анализ таксономической структуры класса ракообразных водных экосистем Беларуси с учетом требований, предъявляемых к тест-объектам 1, 2. Как потенциальный тест-объект выбран вид, принадлежащий к отряду Остракода. Животные выделены из окружающей среды при проведении гидробиологических обследований экосистем Минской области. Определение систематического положения проводили в соответствии с определителями 3, 4, и в лабораторных условиях путем селекции была получена заявленная культура, обладающая чувствительностью к эталонному токсиканту дихромату калия на уровне ЭК 50-9678(70,985,8) мг/дм 3. Культуразарегистрирована под кодом ЦГ-2 и хранится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены (220012 Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 8, тел. 284 13 86, факс 284 03 45) и может быть получена (закуплена) по запросу либо получена заинтересованным лицом из дикой природы путем полного следования нижеуказанным этапам. На фигуре показана схема получения тест-культуры, обладающей чувствительность к эталонному агенту - дихромату калия - в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Исходная лабораторная культура(культура 2 на схеме) была получена из животных, выделенных из природных условий - водных экосистем Минской области, Республика Беларусь (культура 1 на схеме природная (дикая) культура). В лабораторных условиях была получена исходная культура,представляющая собой потомство одной самки - генетически однородна (культура 2 на схеме), в дальнейшем последующие серии культур (на схеме 3132,333 - лабораторная культура .соответственно серий 1, 2, 3 ), полученные из исходной,использовались как тест-объекты для проведения оценки острой водной токсичности (на схеме обозначено как- эксперименты с референсным агентом - дихроматом калия). Последующий отбор проводился с учетом чувствительности к эталонному токсиканту (дихромат калия) и скорости роста культуры в лабораторных условиях (на схеме обозначено как). В итоге была получена лабораторная генетически однородная культура ракообразных, зарегистрированная как ЦГ-2 (на схеме обозначена как 4), обладающая чувствительностью к эталонному агенту - дихромату калия - в следующем диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3, ЭК 16-9625,5 мг/дм 3, ЭК 84-96230 мг/дм 3 (содержится в рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены). Характеристика культуры. Морфология тело заключено в двустворчатую раковину с латерально расположенными створками и снабжено 7 парами конечностей (головной отдел вооружен 4 парами, туловище - 3), при рассматривании сбоку, наибольшая высота раковинки достигает 2/3 ее длины и расположена посередине. Спинной край в средней части сильно выпуклый,брюшной край слабо вогнут в средней части и образует некоторую выпуклость у ротового отверстия. Передний край равномерно и широко закруглен, задний лишь немного уже переднего и косо закруглен. Задний конец закруглен, передний широко заострен. Левая створка превосходит спереди правую приблизительно на ширину своей кутикулярной каемки. Поверхность створок сильно волосиста и скульптирована ясно очерченными маленькими ямочками. На основном фоне желтовато-зеленоватых створок резко выступают 3 пары лентовидных, темных пятен неправильных очертаний, которые идут от спинной стороны сначала поперек створок, а затем переднее пятно простирается вдоль передних краев створок, а два других пятна связываются на спинной стороне таким же пятном,идущим вдоль спинного края. Длина раковинок до 0,7 мм. Культивирование проводится в биологической лаборатории со световым режимом 12 ч день 12 ч ночь при температурах 18-24 С в отстоявшейся не менее 3 суток (дехлорированной) водопроводной воде в стеклянных аквариумах. Для кормления используется 3 15770 1 2012.04.30 альгологически чистая культура водорослей, вносимая ежедневно и поддерживаемая в концентрации 105 клеток/мл. Данные условия являются оптимальными,способствуют поддержанию жизнедеятельности и воспроизводству особей. Отличительная характеристика данной культуры - чувствительность к эталонному агенту - дихромату калия - в диапазоне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3. Оценка острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы с использованием указанной культурызаключается в экспонировании животных водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 96 часов и последующим расчетом медианной эффективной концентрации (ЭК 50). В качестве оцениваемого токсического эффекта расценивается иммобилизация животных отсутствие способности к движению в течение 15 после слабого перемешивания раствора тестируемого вещества. Для экспериментов по оценке острой водной токсичности отбирают особей не старше 2 недель размером 0,3 мм. За сутки до начала тестирования отбираются подвижные юные особи, из которых в день проведения опыта отбирают животных размером не более 0,3 мм. Размер животных определяют по длине раковинки. При выборе животных визуально оценивают их подвижность, поведенческие реакции, отбирая только активных животных. При проведении тестирования необходимо учитывать следующее 1. Если культивационная вода имеет различный состав (рН, жесткость) с водой, используемой для теста, следует адаптировать культуру к тестовым условиям (температура,вода того же состава, что и используемая в тесте в качестве растворителя) в течение не менее 48 часов. 2. Не реже 1 раза в 6 месяцев проводят тест с эталонным веществом для подтверждения, что чувствительность тест-культуры с течением времени не изменилась. В качестве эталонного вещества необходимо использовать дихромат калия. 3. Обязательна постановка не менее двух контролей. При использовании растворителей для повышения растворимости, необходим дополнительный контроль с растворителем. Проведена серия сравнительных экспериментов по оценке острой водной токсичности химических соединений нескольких групп с использованием в качестве тест-объектов предложенной культуры ракообразныхи(наиболее широко используемого стандартного тест-объекта ракообразных). Результаты позволяют утверждать, что культураболее чувствительна по сравнению спо отношению к тяжелым металлам и органическим веществам (например,одноатомным спиртам, хлорорганическим пестицидам). Пример 1. Требуется определить острую водную токсичность нитрата кадмия (соль тяжелого металла). В качестве тест-объекта используют культуру ракообразных, обладающую чувствительностью к референсному веществу - дихромату калия - на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3 (рабочая коллекция Республиканского научно-практического центра гигиены). Тестирование проводили в 2 этапа. Животных экспонировали водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 96 часов при температуре 20 С. В качестве токсического эффекта расценивали иммобилизацию животных. Полученное значение ЭК 50 нитрата кадмия длясоставляет 0,0006 мг/дм 3,в то время как при проведении оценки токсичности с использованиемЭК 50 составляет 0,01 мг/дм 3. Следовательно, культурачувствительнее к действию нитрата кадмия, чем. Пример 2. Требуется определить острую водную токсичность бутанола (органическое соединение - одноатомный спирт). В качестве тест-объекта используют культуру ракообразных, обладающую чувствительностью к референсному веществу - дихромату калия - на уровне 4 15770 1 2012.04.30 ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3 (рабочая коллекция Республиканского научно-практического центра гигиены). Тестирование проводили в 2 этапа. Животных экспонировали водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 96 часов при температуре 20 С. В качестве токсического эффекта расценивали иммобилизацию животных. Полученное значение ЭК 50 бутанола длясоставляет 185 мг/дм 3, в то время как при проведении оценки токсичности с использованиемЭК 50 составляет 1630 мг/дм 3. Следовательно, культурапочти на порядок чувствительнее к действию бутанола, чем. Пример 3. Требуется определить острую водную токсичность пропанола (одноатомный спирт). В качестве тест-объекта используют культуру ракообразных, обладающую чувствительностью к референсному веществу - дихромату калия - на уровне ЭК 50-9678 (70,985,8) мг/дм 3 (культура ЦГ-2 из рабочей коллекции Республиканского научно-практического центра гигиены). Тестирование проводили в 2 этапа. Животных экспонировали водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 96 часов при температуре 20 С. В качестве токсического эффекта расценивали иммобилизацию животных. Полученное значение ЭК 50 пропанола длясоставляет 2510 мг/дм 3, в то время как при проведении оценки токсичности с использованиемЭК 50 составляет 4800 мг/дм 3. Следовательно, данная культурачувствительнее к действию пропанола, чем. Пример 4. Требуется определить острую водную токсичность линдана (хлорорганический пестицид). В качестве тест-объекта используют культуру ракообразных, обладающую чувствительностью к референсному веществу - дихромату калия - на уровне ЭК 50-96-78 (70,985,8) мг/дм 3 (рабочая коллекция Республиканского научно-практического центра гигиены). Тестирование проводили в 2 этапа. Животных экспонировали водными растворами тестируемого вещества в разных концентрациях в течение 96 часов при температуре 20 С. В качестве токсического эффекта расценивали иммобилизацию животных. Значение ЭК 50 линдана длясоставляет 0,006 мг/дм 3, в то время как при проведении оценки токсичности с использованиемЭК 50 составляет 0,083 мг/дм 3. Следовательно, культурана порядок чувствительнее к действию линдана, чем. Таким образом, достигаемый технический результат заключается в расширении арсенала чувствительных тест-объектов при проведении оценки острой водной токсичности тяжелых металлов и веществ органической природы, что позволит избежать недооценки опасности и надежно определить токсичность. Кроме того, данная тест-модель по сравнению с существующими стандартными тест-объектами легче культивируется в лабораторных условиях и свойственна фауне Республики Беларусь. Это позволяет использовать данную тест-модель при проведении экотоксикологической оценки новых потенциально опасных для водной среды химических веществ, внедряемых в хозяйственную деятельность, контроле качества природных и сточных вод, установлении нетоксичной степени разбавления стоков, в природоохранной деятельности. Может использоваться индивидуально и в батарее тестов. Источники информации 1. Брагинский, Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // Гидробиол. журн. - 2000. - Т.36. -5. - С. 50-70. 5 15770 1 2012.04.30 2. ,/ , 2002. - 92 . 3. Бронштейн З.С.Фауна СССР. Ракообразные. В 2 т. . 2 Пресных вод / Редколл. Е.Н.Павловский (гл. ред.) и др. - Л. Изд-во АН СССР, 1947. - 337 с. 4. Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий. Т. 2. Ракообразные. - Санкт-Петербург, 1995. - 628 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6