Штамм бактерий Enterobacter sp. БИМ В-402Д для повышения урожайности растений

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙ. БИМ В-402 Д ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ РАСТЕНИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Суховицкая Людмила Антоновна Сафронова Галина Владимировна Мохова Светлана Валентиновна Мельникова Наталия Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерий. БИМ В-402 Д для повышения урожайности растений. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению экологически безопасных микробных препаратов комплексного действия и представляет собой новый штамм бактерий с неспецифической ростстимулирующей способностью,азотфиксирующей, фосфатмобилизующей активностями, антимикробным эффектом и может быть использован в сельском хозяйстве для бактеризации семян. В области сельскохозяйственной биотехнологии известны способы бактеризации растений путем предпосевной обработки семян. Например, предпосевная инокуляция семян бобовых культур специфичными клубеньковыми бактериями 1. Однако клубеньковые бактерии могут быть использованы исключительно для обработки семян симбиотрофных бобовых культур. Основной задачей исследований в области ассоциативной азотфиксации является изучение азотфиксирующих бактерий корневой зоны небобовых растений, в которой развиваются ассоциативные микроорганизмы, эффективность которых оценивается в основном по признаку азотфиксирующей активности 2 и урожайности определенной небобовой культуры. Однако известны основные механизмы, определяющие эффективность ассоциаций небобовых растений с азотфиксирующими микроорганизмами. Это - азотфиксация, действие гормонов и повышение степени использования растениями элементов минерального питания, антимикробный эффект штаммов-инокулянтов. Известны штаммы несимбиотических ассоциативных бактерий, предназначенные для бактеризации небобовых культур и получения микробных препаратов. 11555 1 2009.02.28 Известен штамм-7 для обработки семян многолетних злаковых трав 3. Недостатком данного штамма является отсутствие ростстимулирующего, антимикробного и фосфаттрансформирующего эффекта. Известен штамм азотфиксирующих бактерийВ-4485 4 для обработки семян зерновых культур и многолетних злаковых трав с целью повышения их урожайности. Недостатком данного штамма является отсутствие антимикробного и фосфаттрансформирующего эффекта. Известен штаммАР, предназначенный для повышения урожайности свеклы 5. Штамм обладает фосфатмобилизующей и ростстимулирующей способностью, но эффективен на узком спектре сельскохозяйственных культур (овощные и корнеплоды) и неспособен к биологической азотфиксации. Известен штаммдля получения микробного препарата для борьбы с болезнями пшеницы и повышения урожайности 6. Недостатком данного азотфиксирующего штамма является отсутствие антибактериального и фосфатмобилизующего действия. Известен штамм-21, предназначенный для получения полифункционального биопрепарата против фитопатогенных грибов и вирусов, стимулирующего рост и развитие растений 7. К недостаткам данного штамма относится отсутствие азотфиксирующей и фосфатмобилизующей активности. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм бактерийдля получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы, повышения количества и качества урожая 8. Недостатком данного штамма являются отсутствие антагонистического воздействия на бактериальные фитопатогены отсутствие фосфаттрансформирующей способности узкий спектр ростстимулирующей активности вызывает сомнение перспективность использования штамма в практике в связи с отсутствием данных о его способности колонизировать корневую систему растений - свойстве, наиболее обусловливающем эффект инокуляции ассоциативными азотфиксаторами растений. Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий. БИМ В-402 Д с широким спектром хозяйственно-ценных свойств, способного к ростостимуляции широкого спектра растений, биологической азотфиксации и фосфатмобилизации,подавлению фитопатогенной микрофлоры растений и высокой приживаемости на корнях(колонизирующая способность). Предлагаемый штамм. БИМ В-402 Д выделен из ризопланы ячменя методом, предложенным Берестецким О.А. и Васюк Л.Ф. 9. Гомогенат корней помещали в полужидкую среду 10. Образцы инкубировали в термостате 72 часа при температуре 26-28 С и проверяли способность накопительной культуры восстанавливать ацетилен 11. Из варианта, обладающего наиболее высокой нитрогеназной активностью, делали высевы на среду Эшби с целью получения изолированных колоний, которые оценивали по азотфиксирующей активности. Отобранный наиболее активный бактериальный изолят идентифицировали (Определитель бактерий Берджи, 1997) как. и депонировали в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-402 Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4 С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2 перевивка - 1 раз в три месяца. Культурально-морфологические свойства. 2 11555 1 2009.02.28 Колонии на мясо-пептонном агаре на 2-3 сутки роста гладкие, серо-белые, прозрачные. Диаметр колоний на указанных средах 2-4 мм. Края ровные, профиль выпуклый. Хорошо и равномерно эмульгируются в воде. Цитология. Грамотрицательные неспорообразующие подвижные, имеющие перит-рихальное жгутикование, палочковидные клетки размером 0,3-0,40,6-1,2 мкм. Отдельные клетки капсулированы. Физиолого-биохимические свойства. Продуцирует -индолил уксусную кислоту. Другие особенности оксидазоотрицателен, каталазаположителен, имеет положительные реакции Вогес-Проскауэра, с метиловым красным, на уреазу, бродильный метаболизм глюкозы в тесте Хью-Лейфсона желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, лактозы, маннита, дульцита, сорбита, арабинозы, рафинозы, рамнозы, мальтозы, ксилозы, трегалозы, целлобиозы, мелибиозы, маннозы, но не использует фруктозы, глицерина, мелецитозы, адонита, инозита. Усваивает цитрат. Особые свойства растет на безазотных средахи Эшби. Не нуждается в факторах роста. Обладает комплексом хозяйственно-ценных свойств ИУК-синтезирующей,азотфиксирующей, фосфатмобилизующей и антимикробной активностями. Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах и кроликах. Установлено, что штамм при внутрибрюшинном введении его суспензии в дозе 500 млн.м.н. мышам и нанесением на скарифицированный участок кожи кроликов такой же дозы суспензии штамма не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного и кожного покрова при клиническом исследовании не наблюдалось. Патологоанатомические исследования органов и тканей отклонений от нормы не выявили. Результаты констатируют отсутствие патогенности и токсичности, что свидетельствует о возможности использования штамма. БИМ В-402 Д в микробиологическом производстве. Штамм. БИМ В-402 Д не фитотоксичен. Фитотоксичность проверена на растениях редиса - традиционном биотесте, обладающем высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам. После обработки кончиков корней проростков редиса культуральной жидкостью бактерий. БИМ В-402 Д и выдерживания их в течение 3 суток в термостате (22-24 С) отсутствия задержки в развитии, некротических пятен,ожогов и других изменений в сравнении с контролем (вода и стерильная питательная среда) не обнаружено, что свидетельствует о нетоксичности бактерий. БИМ В-402 Д для высших растений. Штамм характеризуется широким спектром физиолого-биохимических свойств, определяющих его хозяйственно-ценные признаки (ростстимуляция, биологическая азотфиксация и фосфатмобилизация, подавление фитопатогенной микрофлоры, высокая приживаемость в ризоплане растений и др.), что позволяет использовать его в качестве основы микробного препарата комплексного действия. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры. Пример 1 Штамм. БИМ В-402 Д обладает неспецифичной ростостимулирующей активностью на ранних стадиях онтогенеза растений, которая обусловлена синтезом ауксина -индолил-3-уксусной кислоты (-ИУК). Ростостимулирующее действие. БИМ В-402 Д и влияние продуктов метаболизма на накопление биомассы, изучали по методам, изложенным в руководстве Возняковской, 1969. Семена растений замачивали в водной суспензии культуры (концентрация клеток 108 КОЕ/мл). Контролем служила стерильная водопроводная вода. Обрабо 3 11555 1 2009.02.28 танные семена проращивали в термостате при температуре 28 С в течение 2-3 суток. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что исследуемый штамм обладает неспецифической ростстимулирующей активностью стимулировал рост и развитие проростков 12 видов сельскохозяйственных культур (биомасса бобовых, зерновых, овощных и крестоцветных возросла в сравнении с контролем в среднем на 50, 36, 46 и 14 соответственно), что является преимуществом заявляемого штамма. БИМ В-402 Д по сравнению с прототипом (табл. 1). Пример 2 Ростстимулирующий эффект. БИМ В-402 Д обусловлен продуцированием индольного ауксина (-индолил-3-уксусная кислота). Количество -ИУК, продуцируемое штаммом, определяли колориметрическим методом. Суспензию. БИМ В-402 Д, доведенную до концентрации 108 КОЕ/мл, вносили в количестве 10 от объема среды и инкубировали в течение 1-4 сут. при температуре 28 С в жидкой безазотной средеследующего состава, г/л раствор А глюкоза - 10,0 472 - 0,2 42 Н 2 О - 0,1 47 Н 2 О - 0,005 242 Н 2 О - 0,00024 дистиллированная вода до 500 мл раствор Б 0,005 М калий-фосфатный буфер (рН - 7,1) - 500 мл. Растворы А и Б автоклавировали отдельно и после охлаждения смешивали в соотношении 11. В среду вносили 0,05-триптофана. Таблица 1 Влияние продуктов метаболизма. БИМ В-402 Д на накопление биомассы проростками сельскохозяйственных культур Биомасса проростков растений,СельскоБиомасса проростков обработанных водной суспензихозяйственная в контроле, мг абс. ей. БИМ В-402 Д,культура сух. в. мг абс. сух. в. бобовые Вика 63 124 Люпин 700 880 Горох 250 567 Фасоль 1305 1213 Клевер 20 21 зерновые Пшеница 180 180 Рожь 180 190 Ячмень 63 127 овощные Редис 122 164 Огурцы 104 163 крестоцветные Кресс-салат 28 29 Горчица 33 41 Результаты анализа количественного показали, что. БИМ В-402 Д способен к биосинтезу ауксина как в чистой культуре, так и в ассоциации с инокулированным растением (содержание индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости до 19,0 мкг -ИУК/мл, в растениях ячменя в фазе колошения - 3,92 мкг/г абс. сух. в.)(табл. 2), что подтверждает пролонгированный ростстимулирующий эффект штамма и является его преимуществом. 4 Контроль. В-402 Д Пример 3 Штамм. БИМ В-402 Д обладает нитрогеназной и фосфатмобилизующей активностью, т.е. ассимилирует азот атмосферы и трансформирует труднодоступные ортофосфаты. Результаты определения представлены в табл. 3. Таблица 3 Нитрогеназная и фосфатмобилизующая активность штамма. БИМ В-402 Д Свойства Нитрогеназная активность в чистой культуре,нМоль С 2 Н 4 /фл./сут Азотфиксирующая активность в ассоциации с растением, нМоль С 2 Н 4/раст./сут Фосфатмобилизующая активность, диаметр зон растворения ортофосфатов кальция, мм Азотфиксирующую активность. БИМ В-402 Д в чистой культуре и в ассоциации с ячменем определяли ацетиленовым методом на Хром-4 (Умаров, 1986). Выявлено, что нитрогеназная активность. БИМ В-402 Д в чистой культуре составляла 2,3 нМоль С 2 Н 4/фл./сут, в ассоциации с растениями ячменя - в среднем более чем на порядок превышала контроль. Способность. БИМ В-402 Д трансформировать малоподвижные фосфаты устанавливали чашечным методом по зонам растворения ортофосфатов вокруг колоний этих микроорганизмов на агаризованной глюкозо-аспарагиновой среде Муромцева,следующего состава, г/л глюкоза - 10,0 аспарагин - 1,0 кукурузный экстракт - 0,2 24 0,2 47 Н 2 О - 0,2 агар - 20,0. рН среды до 6,8 доводили 10 раствором . В стерильную среду вносили методом осаждения фосфаты кальция (3,3 г СаС 126 Н 2 О 3,8 г 3412 Н 2 О), алюминия или железа (0,570 г 3 412 Н 2 О 0,362 г АС 36 Н 2 О или 0,405 г 36 Н 2 О). Как вытекает из полученных данных, диаметр зон растворения ортофосфатов кальция штаммом. БИМ В-402 Д достигал 12,4 мм. Трансформация ортофосфатов - важное отличительное свойство. БИМ В-402 Д от прототипа. Пример 4 Штамм. БИМ В-402 Д представляет интерес в качестве потенциального агента биологической защиты, т.к. обладает антагонистическим действием (табл. 4). Способность штамма образовывать вещества антибиотической природы изучали методом блоков (Сэги, 1983). В качестве тест-объектов использовали фитопатогенные грибы и бактерии. Отличительной особенностью штамма. БИМ В-402 Д от прототипа является подавление роста не только фитопатогенных грибов родови ,но и его антибактериальный эффект (ингибирующее действие на рост фитопатогенных бактерий родаи ). 11555 1 2009.02.28 Таблица 4 Антагонистическое действие штамма. БИМ В-402 Д Вид фитопатогенных Диаметр зон ингибирования роста фитопатогенов, мм микроорганизмов 28,31,2128,61,1212,51,5020,00,75. 23,01,0121,02,0124,00,7136,61,23 Пример 5 Свойство, наиболее обусловливающее эффект инокуляции ассоциативными азотфиксаторами растений - колонизирующая способность. Колонизирующую способность штамма. БИМ В-402 Д изучали антибиотикорезистентным методом (Генетические методы селекции клубеньковых бактерий, 1984). Согласно полученным данным(табл. 5), штамм. БИМ В-402 Д обладает высокой колонизирующей способностью и сохраняется на корнях ячменя в течение всего вегетационного периода, что обусловливает эффект диазотрофной инокуляции. Таблица 5 Колонизирующая способность штамма. БИМ В-402 Д(численность в ризоплане корней, млн. КОЕ/г корней) Фазы развития ячменя Вариант опыта кущение выход в трубку колошение созревание Контроль. В-402 Д 0,35 8,00 2,60 0,49 Пример 6 Для сравнения продуктивности штамма. БИМ В-402 Д с прототипомИБ-4 проводили выращивание в колбах на качалке при 200220 об./мин в течение 48 часов, при 28 С на жидких питательных средах Эшби и мелассно-минеральной. Состав среды Эшби, г/л маннит - 20,0 2 НРО 4 - 0,2 47 Н 2 О - 0,2- 0,2 24 - 0,1 СаСО 3 - 5,0, мелассно-минеральной - меласса (разведенная 11) 30,0 (4)24 - 10,0, К 2 НРО 4 - 0,5, КН 2 РО 4 - 0,5. Приведенные в табл. 6 результаты свидетельствуют о более высокой продуктивности заявляемого штамма над штаммом по прототипу. Согласно полученным данным заявляемый штамм. БИМ В-402 Д способен к росту на среде с дешевыми источниками углеводного и азотного питания(мелассно-минеральной). Заявляемый штамм более технологичен получение высокого титра клеток достигается к 48 часам культивирования. Таблица 6 Титр штамма. БИМ В-402 Д при культивировании на разных средах Среда Эшби Мелассно-минеральная среда число жизнеспочисло жизнеспоШтамм время культививремя культивисобных клеток собных клеток рования, ч рования, ч 11555 1 2009.02.28 Пример 7 Оценку эффективности инокуляции двух зерновых культур проводили на экспериментальной базе РНИУП Институт земледелия и селекции НАН Беларуси. Полевые опыты закладывали в соответствии с методикой их постановки (Доспехов, 1979). Статистически достоверно установлено увеличение урожая зерна ярового ячменя на 15,1, озимой ржи - на 11,6 в результате использования для инокуляции штамма. БИМ В-402 Д,обладающего комплексом хозяйственно-ценных свойств (табл. 7). Таблица 7 Эффективность инокуляции зерновых культур штаммом. БИМ В-402 Д Варианты опыта Контроль (906090). В-402 Д НСР 0,95 Яровой ячмень Озимая рожь урожайность, прибавка уро- урожайность, прибавка уроц/га жая, ц/га ц/га жая, ц/га 41,0 40,6 47,2 6,2 45,3 4,7 4,0 3,3 Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования технологичного штамма. БИМ В-402 Д с широким спектром хозяйственно-ценных свойств ИУК-синтезирующей, азотфиксирующей, фосфатмобилизующей, антагонистической активностями и высокой колонизирующей способностью для повышения урожайности растений. Сравнительные характеристики заявляемого штамма. БИМ В-402 Д и штамма прототипа представлены в табл. 8 и 9. Таблица 8 Спектр хозяйственно-ценных свойств штамма. БИМ В-402 Д Свойства 1 2 Стимулировал рост и развитие проростСтимулировал рост ков 12 видов сельскохозяйственных и развитие фасоли культур (биомасса бобовых, зерновых,высоту растений овощных и крестоцветных возросла в на 9,8, вес корней сравнении с контролем в среднем на 50,на 62 . 36, 46 и 14 соответственно) 19,00,06 мкг -ИУК/мл культуральной жидкости в ассоциации с растением 3,920,015 мкг -ИУК /г абс. сух. в. Нитрогеназная активность 2,3 нМоль С 2 Н 4/фл./сут в чистой культуре в ассо 135,1 нМоль С 2 Н 4/раст./сут циации с растением Диаметр зон растворения 10,5-12,4 мм ортофосфатов кальция Колонизирующая способность в процессе вегетации 0,35-8,00 млн. КОЕ /г корней ячменя в чистой культуре 11555 1 2009.02.28 Таблица 9 Спектр антибактериальной активности штамма. БИМ В-402 Д Диаметр зон ингибирования роста фитопатогенов, мм Вид фитопатогенныхИБ-4 микроорганизмов. БИМ В-402 Д(прототип)28,31,2128,61,1212,51,50 12,020,00,75. 23,01,0121,02,0124,00,7136,61,23 Источники информации 1. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. - М. Наука, 1973. 2. Болочний азот / В.П. Патика, С.Я. Коць, В.В. Волкогон и др. За ред. В.П. Патики. К.СВТ, 2003. - С. 157-251. 3. А.с. СССР 1083531 А 1, МПК С 05 11/08, С 12 1/20, 1985. 4. Патент РБ 4632 С 1, МПК С 12 1/20, 2002. 5. А.с. СССР 1723078 А 1, МПК С 05 11/08, С 12 1/20, 1991. 6. Патент 2224791 С 1, МПК С 12 1/20,01 63/00, 2004. 7. Патент 2226214 С 1, МПК С 12 1/20, А 01 63/00, 2004. 8. Патент 2245918 С 1, МПК С 12 1/20,01 63/00, 2005. 9. Берестецкий О.А., Васюк Л.Ф. Азотфиксирующая активность в ризосфере и на корнях небобовых растений // Изв. АН СССР. - 1983. -1. - С. 138-157. 10. .,.//. . . . . - 1975. - . 72,6. - . 1123-1126. 11.Умаров Ацетиленовый метод изучения азотфиксации в почвенно-микробиологических исследованиях // Почвоведение. - 1976. -11. - С. 119-123. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8