Штамм бактерий Bacillus circulans БИМ В-376Д для бактеризации семян зерновых культур

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ В-376 Д ДЛЯ БАКТЕРИЗАЦИИ СЕМЯН ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР(71) Заявитель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт почвоведения и агрохимии(72) Авторы Михайловская Наталья Алексеевна Богдевич Иосиф Михайлович Лученок Людмила Николаевна Журавлева Ольга Викторовна Барашенко Таисия Брониславовна Курилович Нина Николаевна Дюсова Светлана Васильевна(73) Патентообладатель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт почвоведения и агрохимии(57) Штамм бактерийБИМ В-376 Д, способный использовать калий почвенных минералов, для бактеризации семян зерновых культур. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности для получения биопрепарата. Известны штаммы, например штамм 4 с фосфатмобилизующей активностью из коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии 1, или штамм-5987, способный трансформировать нерастворимые фосфаты в доступную для растений форму и синтезировать экзополисахариды, из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 2. Известен также штамм-324 с фосфатмобилизующей активностью 3. Недостатком известных штаммовиявляется ограниченный спектр действия - овощные, плодовые и декоративные культуры. У известных штаммов В.и В.не отмечена способность к биологической мобилизации калия. Целью изобретения является получение штаммас высокой активностью мобилизации почвенного калия из труднодоступных форм, способного улучшать калийное питание и стимулировать рост и повышать урожай зерновых культур. Указанная цель достигнута тем, что методом отбора природных изолятов из ризосферы овса, ячменя, ржи и пшеницы на окультуренных дерново-подзолистых почвах, был по 9646 1 2007.08.30 лучен новый штамм, отличающийся высокой и стабильной активностью по мобилизации калия и стимуляции роста ячменя и овса. Сущность изобретения заключается в том, что штамм-81, выделенный из ризосферы пшеницы на окультуренной дерново-подзолистой супесчаной почве, может быть использован для изготовления биопрепарата с целью улучшения калийного питания, стимуляции роста и повышения урожая зерновых культур. Для получения бактериального препарата штамм выращивают на силикатном агаре ( 6,8-7,2) при температуре 28 С в течение 5-7 суток, смывают стерильной водой или физиологическим раствором и доводят до концентрации 108-109 кл/мл. Штамм-81 имеет следующие культурально-морфологические признаки клетки палочковидные, 0,8-1,0 х 2,0-3,0 мкм, грамположительные, каталазоположительные и оксидазоотрицательные, образуют термоустойчивые споры. На мясопептонном агаре (МПА) с дрожжевым экстрактом через сутки инкубации при 36 С образуют слизистые, выпуклые, непрозрачные блестящие колонии молочно-белого цвета диаметром 3-4 мм. На вторые сутки в центре колонии образуется складчатость. Диаметр колоний 5-6 мм. На 5 сутки колонии принимают складчатую форму. На картофельном агаре (КА) через сутки инкубации при 36 С образуют слизистые,сильно выпуклые, блестящие непрозрачные грязно-белые колонии диаметром 4-5 мм. На вторые сутки четко выделяется центр колонии. На пятые сутки колонии желтовато-белые с диаметром 8-10 мм. В растворе(7,7 ) образуют мелкодисперсный белый осадок. Не нуждается в витаминах для роста, не образует индола, не выделяет сероводород и аммиак. На средах с глюкозой, сахарозой и лактозой образует кислоту. Гидролизует крахмал. Аэроб. Хорошо растет в интервале температур 28-30 С. Оптимальное значение 6,8-7,2. Отношение к источникам углерода хорошо использует глюкозу, сахарозу, крахмал,маннит, арабинозу, ксилозу. Не используют солей органических кислот в качестве единственного источника углерода. Отношение к нерастворимым соединениям фосфора штамм характеризуется способностью к растворению трехзамещенного фосфата кальция. Отношение к нерастворимым соединениям калия штамм отличается способностью использовать калий почвенных минералов слюд (биотита, мусковита) и гидрослюд (гидромусковита). Хранение штамма-81 на твердой питательной среде следующего состава (г/л) сахароза - 5 (4)4 - 1 24 - 2 4 - 0,5 3 - следы алюмосиликат - 1 агар - 20. Температура инкубации 28-30 С, длительность выращивания - 7296 ч. Хранение в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 42 С до 0,5 года или на МПА при температуре 42 С до 1 года. Характерными особенностями штамма-81 являются высокая и стабильная активность мобилизации калия, стимуляция роста и улучшение режима питания зерновых культур. Пример 1. Способность штамма-81 использовать калий почвенных минералов Для определения активности мобилизации калия, штамм-81 высевали в колбы, содержащие по 100 мл жидкой питательной среды следующего состава(г/л) 0,75 г сахарозы, 0,15 г (4)24, 0,3 г 24, 0,075 г 4, 3 - следы, 1 г минерала. Для минимизации содержания подвижного калия в жидкой питательной среде использовали бидистиллят и многократно перекристаллизованные и очищенные от примесей калия реактивы. В качестве единственного источника калия использованы предварительно отмытые водой калийсодержащие почвенные минералы - слюды (биотит и мусковит) и гидрослюды (гидромусковит и глауконит). Количество калия в культуральной 2 9646 1 2007.08.30 жидкости определяли методом пламенной фотометрии после 7-дневной инкубации бактериальной культуры в термостате при 28 С. Количественная оценка активности штамма-81 по мобилизации калия почвенных минералов показала, что при одинаковой степени измельчения минералов штамм К-81 более активно использовал калий мусковита, гидромусковита и биотита(в убывающем порядке). При этом бактерии не использовали калий глауконита (фиг. 1). Пример 2. Способность штамма-81 использовать разные фракции калия из мусковита Эксперимент был проведен с мусковитом, который наиболее активно использовал штамм К-81 по результатам примера 1 (фиг. 1). Целью эксперимента была оценка доступности для бактерий разных по степени подвижности форм калия в мусковите. Перед внесением мусковита в питательную среду с бактериями его предварительно обрабатывали следующими реагентами по Пчелкину 4 вода, 1 н раствор уксуснокислого аммония, 0,2 н соляная кислота, 2 н соляная кислота, 20 соляная кислота. Установлено, что после обработки мусковита дистиллированной водой в течение 2-суток (удаление водорастворимых форм калия) бактерии за 7 суток переводили в раствор примерно в 2 раза больше калия, чем в контроле с минералом без бактерий (фиг. 2). После обработки мусковита 1 н раствором уксуснокислого аммония в течение 2-х суток для извлечения обменных форм калия минерал вновь подвергали действию штамма К-81 в течение 7 суток 4. Установлено, что и после удаления обменных форм калия из мусковита, бактерии переводили калий в раствор, но его количество было в 1,6 раза меньше по сравнению с водной вытяжкой(фиг. 2). Таким образом, установлено, что бактерии способны использовать и менее подвижные формы калия мусковита. После обработки мусковита растворами соляной кислоты разной концентрации (0,2 н,2 н и 20 ) минерал также подвергали воздействию бактерий в течение 7 суток. Эксперимент показал, что бактерии способны переводить в раствор калий и после обработки минерала растворами соляной кислоты. Содержание подвижного калия в культуральной жидкости было в 3,6 раза выше после обработки минерала 0,2 н кислотой, в 5,2 раза выше после обработки 2 н соляной кислотой и в 3,4 раза выше после обработки мусковита 20 кислотой по сравнению с соответствующими контрольными вариантами с питательной средой без внесения силикатных бактерий (фиг. 2). По степени подвижности калий в минералах представлен в водорастворимой, обменной, труднообменной и необменной формах 4. Эксперименты показали, что штамм К-81 использует калий не только из наиболее подвижных его форм в минералах, но и калий из трудноподвижных форм. Пример 3. Эффективность бактеризации ячменя сорта Дзивосны в вегетационном опыте Почва - дерново-подзолистая легкосуглинистая. Агрохимические параметры гумус 2,5- 5,49 Р 2 О 5 - 307 мг/кг К 2 О - 160 мг/кг почвы. Емкость вегетационных сосудов - 5,5 кг почвы. Количество растений на сосуд - 20. Повторность в опыте пятикратная. Действие штамма В.К-81 изучали на двух фонах минерального питания - 0 и 1 ( - 150. Р - 100, 1 - 120 мг д.в./кг почвы). Семена стерилизовали перекисью водорода в смеси с этиловым спиртом (11) в течение 30 мин, проращивали и затем инокулировали жидкой культурой В.К-81(титр 109 кл/мл). Влияние бактерий на растения ячменя оценивали по динамике накопления биомассы в фазах кущения, колошения, молочной и восковой спелости. Штамм В.К-81 оказывал стимулирующее действие на накопление биомассы ячменя (фиг. 3). На фоне удобрений действие штамма К-81 на накопление биомассы ячменя превышало по эффек 3 9646 1 2007.08.30 тивности действие калийных удобрений. Установленная закономерность сохранялась в фазах молочной и восковой спелости (фиг. 3). Под действием бактерий отмечено повышение массы зерна в колосе ячменя (табл. 1). Применение штамма К-81 приводило к увеличению урожая зерна на 11 на фоне удобрений и 14 на фоне -удобрений. Масса 1000 зерен за счет бактеризации увеличивалась на 10(табл. 1). Показано, что бактеризация ячменя штаммом К-81 на фонепо эффективности превышала действие калийных удобрений по влиянию на урожай зерна и массу 1000 зерен. Варианты для сравнения выделены в табл. 1. Таблица 1 Структура урожая ячменя Дзивосны под действием штамма К-81 Вариант Масса зерна в колосе, г Урожай зерна, г/сосуд Масса 1000 зерен, г Пример 4. Эффективность бактеризации овса сорта Эрбграф в вегетационном опыте Почва - дерново-подзолистая легкосуглинистая. Агрохимические параметры содержание гумуса - 2,9 рН- 5,8 Р 2 О 5 - 280 мг/кг К 2 О - 200 мг/кг почвы. Емкость вегетационных сосудов - 5,5 кг почвы. Количество растений на сосуд - 20. Повторность в опыте пятикратная. Семена стерилизовали перекисью водорода в смеси этиловым спиртом (11) в течение 30 мин, проращивали и затем инокулировали жидкой культурой .-81 (титр 109 кл/мл). Действие бактерий К-81 изучали на двух фонах минерального питания - 0 и 1( - 140, Р - 100, К 1 - 96 мг д.в./кг почвы). Влияние штамма К-81 на растения оценивали по следующим показателям динамика численности внесенных В.К-81 на корнях по фазам развития растений урожай зерна и масса 1000 зерен. Установлено, что внесенные при инокуляции бактерии способны заселять ризоплану овса и поддерживать достаточно высокую плотность популяции (табл. 2), что оказывало значительный положительный эффект на формирование урожая овса. Таблица 2 Численность клеток В.К-81 на корнях овса Фенологические фазы развития овса Дозы удобрений кущение колошение молочная спелость численность, тыс./г корней 7200 680 53 Установлено положительное влияние бактерий на урожай овса Эрбграф. Внесение штамма В.-81 приводило к увеличению массы зерна в метелке на 16-19 и массы 1000 зерен на 7-8 на фонах - и -удобрений (табл. 3). За счет применения В.К-81 урожай зерна повышался до 29,3 и 36,8 г/сосуд(на 11 и 18 ) на фонах внесенияисоответственно при урожае на фонахибез бактеризации - 26,5 и 31,1 г/сосуд. Экспериментальные данные показывают, что 4 9646 1 2007.08.30 бактеризация овса В.-81 была наиболее эффективна на фоне внесения удобрений (табл. 3). Таблица 3 Структура урожая овса Эрбграф под действием В.-81 Вариант Таким образом Бактерии-81 способны активно использовать калий из слюд (мусковита и биотита) и гидрослюд (гидромусковита), при этом бактерии не используют калий глауконита. Штамм-81 способен использовать различные по степени доступности формы калия в мусковите - не только водорастворимые и обменные, но и труднообменные и необменные формы. Бактерии-81 значительно стимулируют рост растений, улучшают структуру урожая, что обеспечивает повышение урожая зерна ячменя на 11-14 , овса - на 11-18 . Бактеризация ячменя-81 на фоне -удобрений по эффективности превышала действие калийных удобрений. Штамм-81 может быть использован для изготовления биопрепарата, обеспечивающего улучшение калийного питания, стимуляцию роста и повышение урожайности зерновых культур. Для получения биопрепарата бактерии выращивают на силикатном агаре ( 6,8-7,2) при температуре 28 С в течение 5-7 суток, смывают стерильной водой или физиологическим раствором и доводят до концентрации 108-109 кл/мл. Для использования биопрепарата в условиях сельскохозяйственного производства не требуется дополнительных приспособлений, а производство препарата возможно на предприятиях микробиологического профиля Республики Беларусь. Применение бактерий-81 экологически обосновано и не оказывает негативного действия на окружающую среду. Источники информации 1. Паспорт штамма бактерий, штамм 4 (музей культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии), 1983. 2. Патент Российской Федерации 2081867, 1997. 3. Патент Российской Федерации 2035507, 1995. 4. Пчелкин В.У. Почвенный калий и калийные удобрения. - М. Колос, 1966. - С. 336. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6