Штамм бактерий Bacillus pumilus БИМ В-263, обладающий антагонистической активностью к микроорганизмам – возбудителям болезней растений и животных

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ В-263,ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ К МИКРООРГАНИЗМАМ - ВОЗБУДИТЕЛЯМ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Коломиец Эмилия Ивановна Сверчкова Наталья Владимировна Романовская Татьяна Витальевна Беззубов Валентин Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ -263, обладающий антагонистической активностью к микроорганизмам - возбудителям болезней растений и животных. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению биологических средств защиты растений и экологически безопасных дезинфектантов для животноводства и представляет собой новый штамм с широким спектром антимикробного действия, обуславливающим его фотозащитный и дезинфицирующий эффект. Известен штаммВ-30087, активный в отношении грибных патогенов растений 1. Однако данный штамм не обладает активностью против возбудителей болезней растений и животных бактериальной этиологии. Известен штаммМ-22 ВИЗР, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий 2. Недостатком штамма является узкий спектр антимикробного действия, потребность в дорогостоящих источниках питания, таких как кукурузный экстракт и продолжительность выращивания трое суток, что негативно сказывается на экономических показателях ферментационного процесса. Известен штаммКМБУ 30043 - антагонист фитопатогенных микроорганизмов 3. Недостатками данного штамма являются подавление развития как фитопатогенной, так и полезной бактериальной и грибной почвенной микрофлоры, а также использование в основе препарата живых клеток продуцента, а не спор, что негативно сказывается на сохранности и качестве биопрепарата. 9685 1 2007.08.30 Известен штамм. -01-600 4, активный в отношении токсических и патогенных бактерий,. Однако данный штамм не обладает активностью против бактериальных и грибных инфекций растений. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм-333, рекомендованный для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов 5. Данный штамм использован в качестве прототипа. Показана его активность против фитопатогенных бактерий родов . Недостатками данного штамма являются 1. Невысокая антагонистическая активность в отношении указанных бактериальных фитопатогенов. 2. Узкий спектр антифунгального действия. 3. Отсутствие антагонистической активности в отношении бактериальных патогенов животных. 4. Вызывает сомнение перспективность использования штамма в производственных условиях, поскольку основу препарата составляют живые клетки продуцента, а не споры,что негативно влияет на качество и сохранность препарата, а для культивирования штамма используют дорогостоящие источники питания - дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, сахарозу, что экономически невыгодно. Задачей изобретения является получение нового штамма бактерийкомплексного действия с высокой антагонистической активностью к возбудителям бактериальных болезней растений и животных, способного к росту и продукции антимикробных метаболитов на относительно дешевых и простых по составу питательных средах. Предлагаемый штаммБИМ В-263 выделен из филлопланы виноградной лозы, депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-263. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории биометода защиты растений ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4 С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2 перевивка - 1 раз в 6 месяцев. Культурально-морфологические свойства При поверхностном культивировании на мясо-пептонном агаре образует округлые колонии с зубчатым краем, поверхность гладкая, консистенция вязкая, профиль плоский,чуть приподнятый по краям. Образует по краям ареол ризоидного роста. Клетки подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,6-0,71,0-1,3 мкм. Споры эллипсовидные, расположены центрально или терминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены преимущественно одиночно и в парах, цепочек нет. Окраска по Граму положительная. Физиолого-биохимические признаки Аэроб. Растет при температуре 20-50 С. Оптимум 30-37 С. Отношение к источникам углерода утилизирует глюкозу, сахарозу, галактозу, маннозу, рамнозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, маннит, инозит, дульцит, разжижает желатину, гидролизует казеин, не утилизирует арабинозу,глицерин, ксилозу, сорбит, не гидролизует крахмал. Отношение к источникам азота ассимилирует сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат калия, пептон, кукурузный и дрожжевой экстракт, не ассимилирует мочевину, не восстанавливает нитраты до нитритов. Другие особенности характеризуется каталазной активностью, образует ацетоин, не разлагает тирозин, растет на среде Мейнелла и в 7, не растет на среде Чапека. Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах. Установлено, что штамм при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении его суспензии во всех исследуемых концентрациях от 105 до 2 9685 1 2007.08.30 1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с контрольными не выявлено. При введении фильтрата 7-суточной жидкой культуры В.БИМ В-263 подкожно в заднюю лапку в количестве 0,5 мл гибели опытных животных и некроза тканей на месте введения не выявлено. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве. Штамм В.БИМ В-263 не фитотоксичен. Фитотоксичность проверяли на растениях редиса. Эта культура является традиционным биотестом, так как обладает высокой чувствительностью к фитотоксическим препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры. Для проведения анализа кончики корня проростков редиса помещают на 1 ч в культуральную жидкость бактерий. Контрольные проростки помещают в воду и стерильную питательную среду. После этого проростки раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, помещают в термостат (22-24 С) и выдерживают несколько дней. Отсутствие задержки в развитии, некротических пятен, ожогов и других изменений по сравнению с контролем свидетельствует о нетоксичности бактерий В.БИМ В-263 для высших растений. Штамм характеризуется широким спектром антагонистического действия, что позволяет использовать его для контроля болезней растений и в качестве дезинфектанта в животноводстве. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры. Пример 1 Для изучения спектра антимикробного действия штамма В.БИМ В-263 использовали метод лунок. Для этого чашки Петри с 2 агаризованным бульоном Хоттингера заливают вторым 1,2 агаризованным слоем бульона Хоттингера с тест-культурой патогена, выросшей до экспоненциальной фазы роста в жидкой питательной среде. Затем сверлом (диаметром 8 мм) делают лунки, в которые вносили исследуемый антагонист. Результаты оценивали через 1-3 суток после инкубации при 28-30 С по зонам лизиса или зонам задержки роста патогенных тест-культур (табл. 1, 2). Таблица 1 Спектр антибактериальной активности штамма В.БИМ В-263 В..БИМ В-263 333 (прототип) Виды бактерий метод лунок, (ради- метод реплик, (стерадиус зоны подавления ус зоны подавления пень подавления роста, мм роста, мм) роста, ) Патогены растений 10 85 1,510 85 10 9685 1 2007.08.30 Таблица 2 Спектр антифунгальной активности штамма В.БИМ В-263-333 (прототип) Виды грибов метод лунок (радиус метод реплик (стерадиус зоны подавзоны подавления пень подавления росления роста, мм роста, мм) та, )121 8512.52 75 213 94,6 20 319 86,5 71 58233 85 311 75 312-16 961 Зона лизиса тест-культур 2 зона ослабленного роста тест-культур 3 зона нарастания бактерий В.БИМ В-263 на тест культуры. Методом лунок определяли также антагонистическую активность штамма В.БИМ В-263 в отношении сапрофитой микрофлоры (табл. 3). Таблица 3 Антагонистическая активность штамма В.БИМ В-263 в отношении сапрофитной микрофлоры Сапрофитные микроРадиус зоны подавления роста, мм организмы В.БИМ В-263 В.-333(прототип) Виды бактерийнет данныхнет данныхнет данных Виды грибовнет данныхнет данных Для определения степени подавления патогенных микроорганизмов исследуемой культурой использовали метод реплик. Для этого чашки Петри с 2 агаризованным бульоном Хоттингера заливают вторым 1,2 агаризованным слоем бульона Хоттингера с антагонистом В.БИМ В-263 (титр -5,4109 клеток, мл) в количестве 1 мл антагониста и 4 мл среды. На поверхность подготовленных таким образом чашек Петри с антагонистом репликатором наносят бактериальные и грибные патогенны. Совместное инкубирование проводят при 28-30 С. Степень подавления роста тест-объектов оценивали через 1-5 суток (табл. 1, 2). Анализ полученных данных свидетельствует о том, что исследуемый штамм имеет широкий спектр действия ингибирует развитие фитопатогенных грибов и бактериальных 4 9685 1 2007.08.30 возбудителей болезней растений и животных, не оказывая негативного влияния на полезную микрофлору, что является преимуществом заявляемого штамма В.БИМ В 263 по сравнению с прототипом. Пример 2 Бактерии штамма В.БИМ В-263 выращивают в условиях глубинной ферментации в течение 36-48 часов при 28-30 С на питательных средах, основу которых составляют соли среды Мейнелла (г/л 2432 - 7,0 24 - 3,0 472 - 0,1 43 - 1,0 -цитрат - 0,5), а в качестве источников углерода используют мелассу, как более дешевый субстрат, или сахарозу. Оценивают титр клеток и спор. Согласно полученным данным (табл. 4) заявляемый штамм В.БИМ В-263 способен к росту на среде с более дешевыми источниками углеводного и азотного питания - мелассой и аммонием азотнокислым, а также характеризуется активным спорообразованием, что положительно влияет на качество и сохранность препарата, в отличие от прототипа, где для приготовления препарата путем выращивания штамма на агаризованной среде используется сахароза,дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, что экономически невыгодно. Таблица 4 Показатели роста и спорообразования штамма В.БИМ В-263 Продолжительность выращивания В.БИМ В-263 Источник углерода 36 ч 48 ч Меласса Титр, клеток/мл 3,9109 5,4109 Доля спор,65-70 75-80 Сахароза Титр, клеток/мл 4,1109 5,5109 Доля спор,60-65 75-78 Пример 3 В модельных экосистемах с почвой оценен фитозащитный эффект (на проростках ячменя) жидкого препарата на основе штамма В.БИМ В-263. Снижение инфекционного фона способствовало более активному развитию проростков ячменя (.) (табл. 5). Статистически достоверный фитозащитный эффект биопрепарата на основе штамма наблюдался при норме внесения препарата в почву 2,0-4,0 . При этом средняя масса проростков на почве, предварительно инфицированной .- 55043 или .181, увеличивается соответственно на 17-23 и 10-24 . Наряду с фитозащитным отмечено ростстимулирующее действие препарата на развитие растений (табл. 5). Таблица 5 Влияние биопрепарата на основе штамма В.БИМ В-263 на развитие проростков ячменя в модельных экосистемах Масса проростков Концентрация Варианты биопрепарата,п/пк контролю от веса почвы мг К 1 К 2 К 3 1. Почва (К 1) 12,90,6 100,0 2. Почва .12,1 0,4 93,8 100,0 УКМ -55043 (К 2) 3. Почва .181 (К 3) 12,20,4 94,6 100,0 4. Почва В.1 13,00,6 100,8 БИМ В-263 2 14,00,7 108,5 4 14,70,7 114,0 5(в пересчете на 1 растение) биопрепарата,к контролю от веса почвы мг К 1 К 2 К 3 1 13,70,6 106,2 113,2 2 14,90,7 115,5 123,1 4 14,20,6 110,1 117,4 1 13,10,5 101,6 107,4 2 13,40,5 103,9 109,8 4 15,10,7 117,1 123,8 0,6 4,5 2,0 3,5 Результаты лабораторных исследований подтверждены полевыми опытами, проведенными сотрудниками РУП БелИЗР НАН Беларуси в саду интенсивного типа колхоза Узденский Узденского района Минской области против возбудителей раковых болезней яблони (. ,.), в которых показана эффективность использования биопрепарата на основе штамма В.БИМ В-263 в составе замазок для залечивания раковых ран яблони. Так, при нанесении препарата непосредственно на рану с последующим использованием лечебной замазки биологическая эффективность составила 54 , что в 2,6 раза выше, чем при использовании лечебной замазки без препарата. В контрольном варианте без лечения наблюдали увеличение площади ран (на 55,4 ) (табл. 6). Таблица 6 Биологическая эффективность штамма В.БИМ В-263 при лечении раковых ран плодовых Размер ран Площадь за- Биологическая Вариант живления ран, эффективность,После До лечения см 2(20 мл/кг)ЛЗ Пример 4 Эффективность действия биологического препарата на основе штамма В.БИМ В-263, используемого в качестве дезинфектанта, была оценена по его влиянию на инфекционный фон животноводческих помещений после содержания в них животных. Испытания опытного образца препарата проводили на свинокомплексе Борисовский Борисовского района Минской области в секциях поросят на доращивании. Опытную секцию после содержания в ней молодняка до 106-ти дневного возраста обрабатывали биопрепаратом в концентрации 3,0108 клеток/мл и 2,4107 спор/мл аэрозольным методом. Наполнение животноводческой секции аэрозолью биопрепарата было хорошим при видимости несколько метров. Пробы воздуха брали до распыления препарата, а затем через двое, семеро, четырнадцать суток после обработки. 6 9685 1 2007.08.30 Результаты исследования микробного обсеменения воздуха животноводческой секции до и после дезинфекционной обработки биопрепаратом представлены в таблице 7. Таблица 7 Рост общей и санитарно-показательной микрофлоры после обработки биопрепаратом на основе штамма В.БИМ В-263 Группа кишечной Группа стафилококкоОбщая микрофлора палочки стрептококковая Пробы эффективэффективэффектив 3 3 3 тыс/м ность обтыс/м ность обратыс/м ность обраработки,ботки,ботки,До обработки 120 4,69 8,3 После обработки через 2 суток 26,4 78 100 1,34 84 7 суток 50,1 58 0,12 87,5 2,7 68 14 суток 119 0,75 84 16,6 Таким образом, использование биопрепарата на основе штамма В.БИМ В-263 в качестве дезинфектанта позволило снизить обсемененность воздуха секции для молодняка свиней бактериями группы кишечной палочки на 100-87 , бактериями группы стафилококко-стрептококковой на 84-68 , общей микрофлорой на 78-58(через двое и семеро суток после обработки соответственно). При этом рост бактерий группы кишечной палочки практически отсутствовал и на 14-е сутки после обработки. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования штамма В.БИМ В-263 с широким спектром антимикробного действия для биологического контроля патогенов сельскохозяйственных растений и животных. Источники информации 1. Патент 6245551 В 1, МПК С 12 1/20, 2001. 2. Патент 2084152 С 1, МПК А 01 63/00, С 12 1/20// (С 12 1/20, С 12 1125), 1997. 3. Патент 3962 С 1, МПК 01 63/00, 2001. 4. Патент 6399056 В 1, МПК 01 63/00, 2002. 5. А.с.1817875 3, МПК 01 63/00, С 12 1/20, 1995 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7