3,5-Дизамещенные производные тиотетроновой кислоты, проявляющие антифосфолипазную активность антипанкреатического профиля действия, и способ их получения

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ 3,5-ДИЗАМЕЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ТИОТЕТРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ АНТИФОСФОЛИПАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ АНТИПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ ДЕЙСТВИЯ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Рубинов Дмитрий Брониславович Желдакова Татьяна Анатольевна Литвинко Наталья Михайловна Кучуро Светлана Викторовна Рахуба Галина Николаевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. 3,5-Дизамещенные производные тиотетроновой кислоты общей формулы где 1 означаетили ,2 означаетили ,проявляющие антифосфолипазную активность антипанкреатического профиля действия. 2. Способ получения соединений по п. 1, заключающийся в том, что осуществляют конденсацию 2-ацетилтиотетроновой кислоты с ароматическими бензальдегидами с последующим восстановлением образующихся виниларильной или кетовиниларильной группировок. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что конденсацию проводят в условиях кислотного или основного катализа. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что восстановление проводят методами ионного гидрирования или каталитического гидрирования на палладии. Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новым биологически активным веществам, - 3,5-дизамещенным производным тиотетроновой кислоты общей формулы где 1 означает Н или В,2 означает Н или С 1,которые могут найти применение в качестве ингибиторов секреторной фосфолипазы А 2 поджелудочной железы, а именно в качестве противовоспалительных средств антипанкреатического профиля действия, и способу их получения. Известны биологически активные 3-ацил-2,4-тиофендионы (2-4), проявляющие противоартритные 1, иммуносупрессорные 2, антибактериальные свойства 3, являющиеся структурно родственными природным антибиотикам тиолактомицину и тиотетромицину,выделенным из почвенных бактерий рода 4. Соединения (4), имеющие достаточно объемную гидрофобную алициклическую цепь, ингибируют фосфолипазу А 2 (ФЛА 2 К.Ф. 3.1.1.4) форменных элементов крови и синовиальной жидкости 3. 2,галоген,алкил или алкокси 3,галоген, алкил, алкокси 4,Н, , , ,1-15,0-20. Существенные изменения уровня активности ФЛА 2, катализирующей гидролиз фосфолипидов по 2-му положению глицеринового скелета, наблюдаются при остром панкреатите, воспалительных процессах, патогенетических поражениях печени, гипоксии,аллергии и тромбообразовании, отеках вследствие радиационного поражения и развитии злокачественных новообразований. Накопление продуктов ферментативного гидролиза фосфолипидов в органах и тканях является признаком ишемической болезни и следствием активации ФЛА 2. Клеточные ФЛА 2 играют ключевую роль в биосинтезе активных метаболитов арахидоновой кислоты. Однако соединения (2-4) могут быть полезны только при лечении расстройств, вызываемых продуктами окисления арахидоновой кислоты, которая высвобождается из фосфолипидов под действием внутриклеточной высокомолекулярной (80 кДа и выше) фосфолипазы А 2, содержащейся в форменных элементах крови. В круг таких заболеваний входят иммуновоспалительные заболевания, аллергия, анафилаксия и воспаление, вызванное только оксилипинами (продуктами окисления арахидоновой кислоты), аллергические риниты, аллергическая бронхиальная астма, бронхиальные обструктивные расстройства верхних дыхательных путей, а также различных прямых гиперчувствительных реакций, таких как аллергический конъюктивит, воспалительные процессы, имеющие место при ревматоидных артритах, остеоартритах, тенденитах, бурситах, псориазе и др. Таким образом недостаток указанных соединений - ограниченный спектр их действия,распространяющийся только на группы фосфолипаз, входящих в один из пулов суперсемейства липолитических ферментов фосфолипаз А 2 и представляющих собой внутриклеточные высокомолекулярные ферменты, у которых в каталитическом акте участвует аминокислота серин 5. Вместе с тем в данном суперсемействе ФЛА 2, объединяющем 11 классификационных групп 5, имеется еще один пул, к которому относятся внеклеточные 2 10191 1 2008.02.28 низкомолекулярные (12-18 кДа) ферменты, выделяемые железами внутренней секреции млекопитающих (поджелудочная железа, семенники, селезенка, тимус), у которых установлено участие другой аминокислоты гистидин в каталитическом акте 6. В то же время известно, что нежелательное увеличение активности низкомолекулярной ФЛА 2 поджелудочной железы наблюдается при течении острого панкреатита, что приводит к развитию тяжелого некроза с летальным исходом 7. Задачей настоящего изобретения являются новые производные тиотетроновой кислоты общей формулы, отличающиеся новым спектром действия на низкомолекулярные формы ФЛА 2 антипанкреатического профиля. Поставленная задача решается заявляемыми соединениями, проявляющими ингибиторные свойства по отношению к активности низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А 2 (ФЛА 2) и являющимися потенциальными лекарственными средствами антипанкреатического профиля. Биологическое действие заявляемых соединений подтверждено тестированиемс использованием панкреатической ФЛА 2, результаты которого приведены в разделе Исследование биологической активности. Другой задачей изобретения является способ получения заявляемых соединений. Известен способ получения соединений 2-4 путем ацилирования производных тиотетроновой кислоты соответствующими хлорангидридами карбоновых кислот. Для 2-ацетилциклоалкан-1,3-дионов (5 а) 8, так и для их гетероциклических аналогов производных тетроновой и тетрамовой кислот (5 б) 9, 10, известен метод функционализации боковой ацильной цепи -трикетонной системы, состоящий в конденсации -трикетонов с ароматическими альдегидами Для этих соединений наблюдается региоселективная реакция с образованием продуктов конденсации строго по ацильной цепи. Однако этот метод не позволяет провести модификацию циклической части -трикетонной системы. Следует отметить, что производные тиотетроновой кислоты являются исключением в данном ряду трикетонов,поскольку они конденсируются не по боковой цепи, а по метиленовой группе цикла 1. Известен также способ получения производных 2-ацетилтиотетроновой кислоты, модифицированных и по боковой ацильной цепи и по циклу (4) 3 (прототип), который осуществляется в две стадии. На первой стадии проводится ацилирование тиотетроновой кислоты соответствующим по структуре ацилирующим агентом, что позволяет сразу ввести функционализованную боковую цепь, однако для этого требуется дополнительная многостадийная процедура получения необходимого ацилирующего агента. На второй стадии полученная 2-ацилтиотетроновая кислота конденсируется с ароматическим альдегидом, при этом модификации подвергается тиофендионовый цикл. Недостаток прототипа - необходимость проведения двух различных по природе реакций, а также предварительной стадии синтеза ацилирующего агента. Поставленная задача достигается созданием универсального способа получения заявляемых соединений - 3,5-дизамещенных производных тиотетроновой кислоты (1), имеющих модификации либо только по циклической части молекулы, либо одновременно и по циклу, и по цепи, суть которого демонстрируется приведенной схемой и состоит в следующем. 3 7,Н , 1 Н, 2 С (б), 12 ОМе (в), 1, 2 Н (г) 8, 1234 Н , 13 Н, 24 С (б), 13, 24 Н (в),1234 ОМе (г), 123 Н, 4 С (д), 12 ОМе, 34 Н (е),12 Н, 34 ОМе (ж) 10, 1234, 123, 4(б), 12, 34(в),1234 ОМе (г). 3-Ацетилтиотетроновую кислоту (6) конденсируют с ароматическими бензальдегидами,получая в зависимости от природы используемого катализатора (трифторуксусная кислота или пиперидин) и количество альдегида (1,1 экв или 2,5 экв) моноконденсированные (7) или диконденсированные (8) продукты. Последующая восстановительная трансформация методами ионного либо каталитического гидрирования виниларильной и кетовиниларильной группировок в этих соединениях расширяют ряд доступных производных тиотетроновой кислоты за счет образующихся соединений (9-12). Основные отличия заявляемого способа состоят в том, что функционализацию циклической части тиофендионового цикла и боковой ацетильной группы проводят в одну стадию без выделения промежуточного продукта моноконденсации, а в качестве модифицирующих агентов используются доступные реагенты - ароматические альдегиды. Кроме того,заявляемый способ позволяет легко вводить разнообразные арильные заместители в боковую ацильную цепь и, тем самым, упростить получение 3,5-дизамещеных производных тиотетроновой кислоты. Приведенные ниже примеры получения заявляемых соединений подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Конденсация 3-ацетилтиотетроновой кислоты (6) с альдегидами. Раствор 1.58 г (10 ммол) 3-ацетилтиотетроновой кислоты (6), 11 ммол соответствующего ароматического альдеги 4 10191 1 2008.02.28 да и 0.2 мл пиперидина в 50 мл толуола кипятили с азеотропной отгонкой воды 8-12 час до окончания водоотделения (контроль ТСХ). При охлаждении реакционной смеси до комнатной температуры из нее выпадали кристаллы 5-арилметилиденпроизводных (6 а-д),которые перекристаллизовывали из смеси метанол - этилацетат. Для получения продуктов двойной конденсации (8 а-г,з) в реакции использовали 25 ммол соответствующего альдегида. Синтез продуктов (8 д-ж) осуществляли по вышеприведенной методике в две стадии,без выделения промежуточного продукта. При этом на первой стадии использовали эквивалентное количество альдегида, создающего арилметилиденовый заместитель в цикле, а на второй - 1,5 экв другого альдегида, конденсирующегося по боковой цепи. 3-Ацетил-5 фенилметилиден-2,4-(3)тиофендион (7 а). Выход2.02 г (82 ). Т. пл. 147-150 С (лит. 151-152 С 7). ИК спектр, , см-1 1660, 1640, 1620, 1580, 1565. Спектр ЯМР 1 Н, , м.д. 2.62 с (3 Н, СН 3), 7.40-7.50 м (3 Н, ), 7.55-7.60 м (2 Н, ), 7.86 с(1,), 8.06 с (2 Н, С(О)СНСН), 16.36 ушир. с (1, енол). Найдено,С 67.08 Н 4.718.22394. 22185. Вычислено,С 66.99 Н 4.608.13. 3-(Е)-3-(3,4-Диметоксифенил)-2-пропеноил-5-(Е)-фенилметилиден-2,4-(3)тиофендион (8 ж). Выход 2.20 г (56 ). Т. пл. 178-180 С (разл.). ИК спектр, , см-1 1695, 1630,1600, 1535. Спектр ЯМР 1 Н, , м.д. 3.97 с и 3.99 с (6 Н, СН 3 О), 6.94 д (1, МеОССНСН, 8.0 Гц), 7.22 д (1, МеОС-С(ОМе)СНС,2.0 Гц), 7.32 дд (1, МеОССНСН, 1 8.0 Гц, 2 2.0 Гц), 7.40-7.52 м и 7.60-7.68 м (3 Н и 2 Н, С 6 Н 5), 7.84 с (1,), 7.90 д и 8.07 д (2 Н, С(О)СНСН,16.0 Гц), 16.30 ушир. с (1 Н, енол). Найдено,С 66.92 Н 4.588.16.394. 22185. Вычислено,С 66.99 Н 4.608.13. 52-Фурилметилиден-3-(Е)-3-(2-фурил)-2-пропеноил-2,4(3)тиофендион (8 з). Выход 2.00 г (64 ). Т. пл. 199-203 С (разл.). ИК спектр, , см-1 1700, 1620, 1580, 1530. Спектр ЯМР 1 Н, , м.д. 6.60 м (2 Н, ОСН 2), 6.82 д и 6.89 д (2 Н, ОССНСН 2, 4.0 Гц), 7.64 д и 7.70 д (2 Н, ОСНСН 2,2.0 Гц), 7.63 с (1,), 7.84 с (2 Н,С(О)СНСН), 16.40 ушир. с (1, енол). Найдено,С 61.31 Н 3.2910.27.314. 16105. Вычислено,С 61.14 Н 3.2110.20. Каталитическое гидрирование продуктов конденсации (7 а) и (8 а,г-е). Раствор 5 ммол ненасыщенного соединения в 50 мл метанола гидрировали при комнатной температуре и нормальном давлении в присутствии 100 мг 10 -ногона угле до полного насыщения водородом (ТСХ). Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в хлороформе, пропускали через слой силикагеля(10 г). Выход 2.25 г (98 ). Т. пл. 116-117 С (гексан). ИК спектр, , см-1 1700, 1635, 1610,1585, 1560. Спектр ЯМР 1 Н, , м.д. 2.95 т (2 Н, СОСН 2,7.5 Гц), 3.22 т (2 Н, СОСН 2 СН 2, 7.5 Гц), 3.35 м (1 Н, РСНН), 3.82-3.92 м (2 Н, РСН, ), 3.86 с, 3.89 с, 3.95 с и 3.98 с (12 Н, 4 ОСН 3), 6.80-7.22 м (6 Н, 2 С 6 Н 3), 12.80 ушир. с (1, енол). Найдено,С 63.00 Н 5.817.07.458, 459. 24267. Вычислено,С 62.87 Н 5.726.99. Ионное гидрирование соединений (7 а) и (8 а). К раствору 1 ммол трикетона в 5 мл трифторуксусной кислоты (ТФУК) добавляли 2 мл 1 -ного раствора перхлората лития в ТФУК и 2.0 мл (12.5 ммол) триэтилсилана. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 8-12 час (контроль ТСХ). Избыток реагентов и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 50 мл хлороформа, однократно промывали водой, сушили сульфатом магния, хлороформ упаривали в вакууме. 5-Бензил-3-этил-2,4-(3,5)тиофендион (11). Выход 0.14 г (60 ). Маслообразное вещество. ИК спектр, , см-1 1750, 1705, 1610. Спектр ЯМР 1 Н, , м.д. 1.00 т (3 Н, СН 3,7.5 Гц), 2.24 кв (2 Н, СН 3 СН 2,7.5 Гц), 2.93 дд (1, СНР 1 14.0 Гц, 2 10.0 Гц), 3.55 дд(1, , 1 10.0 Гц, 2 4.0 Гц), 7.20-7.40 м (10 Н, С 6 Н 5), 10.00 ушир. с (1, енол). Найдено,С 73.98 Н 6.119.94.324. 20202. Вычислено,С 74.04 Н 6.219.88. Исследование биологической активности. Смешанные мицеллы получают солюбилизацией раствором детергента пленки, образующейся после удаления растворителя из раствора фосфатидилхолина (ФХ) в хлороформе. Смешанные мицеллы готовят включением фосфатидилхолина в фазу поверхностноактивных веществ - дезоксихолата натрия (ДОХ, анионный детергент) и тритона-Х-100(ТХ, неионный детергент) при оптимальном соотношении 12. Реакционная смесь содержала 2 мМ СаС 12 и 0,05 М трис-, рН 7,4. Реакцию гидролиза смешанных мицелл начинают добавлением в среду при 37 С раствора панкреатической ФЛА 2 (0,06 ед./мл) и останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ. Преинкубация фермента с производными тиотетроновой кислоты продолжается в течение 80 мин. Продукты ферментативной реакции из реакционной среды экстрагируют двумя объемами смеси хлороформ/метанол 21 (по объему). Степень экстракции составляет не менее 85 . Нижний слой отделяют, растворитель упаривают и продукты реакции анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65254. Пластины проявляют реагентом на фосфолипиды, пятна фосфолипида и его лизопроизводного выскребают и анализируют в них содержание фосфора по методу,7 10191 1 2008.02.28 описанному в работе 11. За единицу активности фермента принимают количество ФЛА 2 поджелудочной железы, катализирующее образование 1 мкмоль продукта / мин 37 С. На основе изменения скорости гидролиза ФХ (мкмольмин -1 мг -1) в мицеллярной фазе под действием ФЛА 2 поджелудочной железы в отсутствие (0) и в присутствиипроизводных тиотетроновой кислоты обнаружено что по глубине воздействия на липолиз наиболее существенное ингибиторное действие оказали дихлорзамещенное арилметилиденовое производное (8 б) и не содержащее олефиновых связей ни в цикле, ни в боковой цепи трикетон (10 а) на всем временном интервале скорость гидролиза ФХ после преинкубации фермента с (8 б) и (10 а) была вдвое ниже контрольной величины (фиг.). Скорость гидролиза фосфолипазой 2 поджелудочной железы свиньи фосфатидилхолина (ФХ) в мицеллярной фазе, сформированной дезоксихолатом натрия. Скорость гидролизавыражена в количестве образовавшегося продукта реакции (мкмоль) в единицу времени (мин) на мг белка. Концентрация, при которой проявлялся максимальный эффект производных тиотетроновых кислот (ТТК) для суммарной концентрации компонентов мицеллярной фазы 1,53 мкмоль/млТТК-03 (5-бензил-3-(3-фенил)пропаноил-2,4(3,5)-тиофендион) - 2 мкмоль, ТТК-04 (5 фенилметилиден)-33-(3-хлорофенил)-2-пропеноил 2,4(3,5)-тиофендионом) - 1,1 мкмоль, ТТК-05 (5(3-хлорфенил)метилиден-33-(3 хлорфенил)-2-пропеноил-2,4(3,5)-тиофендион) - 0,8 мкмоль, ТТК-06 (5(4-бромфенил)метилиден-33-(4-бромфенил)-2-пропеноил-2,4(3,5)-тиофендион) - 1,1 мкмоль. Общий объем реакционной смеси 1 мл (Соотношение липиддетергент 12) Источники информации 1.. М. // . . . (С). - 1968. - 1501. 2..,. // . . - 1983. - 36. - 1589. 3. Патент США 5366993, .1507 333/1661 31/38. с, .А.,С 1, С.Е., , , о ,заявки 71627. Заявл. 03.06.1993 (прототип). 4.Т.,.,.,.,. // . . - 1982. - 35. - 401. 5. , , // . . . - 2000. -1006. - 1-9. 6. Литвинко Н.М. Активность фосфолипаз А 2 и С при биохимическом моделировании. Мн., 2002. 7. , Т. . (1988) . . , 23, 897-904. 8. Рубинов Д.Б., Рубинова И.Л., Ахрем А.А. // ХПС. - 1995. -5. - 635. 9. Пашковский Ф.С., Каток Я.М., Хлебникова Т.С., Королева Е.В., Лахвич Ф.А. // ЖОРХ. 2003. - 39. - 1060. 10. Лахвич Ф.А., Пашковский Ф.С., Лис Л.Г. // ЖОРХ. - 1992. - 28. - 1626. 11..Е., Ко , . . - 1975. - . - 114. - 1. . 129-141. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8